蛋白质定量方法

简介

精确的蛋白质定量是蛋白质相关实验所必需的，这些实验涉及分子生物学，细胞生物学，生物化学，发育生物学和神经科学的研究课题。 蛋白质定量分析有多种不同方法，包括样品的总蛋白定量和单种蛋白成分的定量。 总蛋白定量的分析方法，包括传统方法，例如测量在280 nm的紫外吸光值，二喹啉酸（BCA）和Bradford检测法，以及其他替代方法，例如Lowry检测法或由公司开发的新型检测试剂盒。针对总蛋白定量分析的每种方法，商业公司都专门开发了方便易用的试剂盒。 单种蛋白质的定量方法，包括酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫印迹分析，以及最近的质谱等。 我们讨论蛋白质定量的一些常用方法，并且指出这些方法的用途和局限。值得注意的是，所有这些蛋白质检测方法都既不是蛋白质特异的（一些非蛋白质成分可能会干扰检测值），也不是对所有的蛋白质都同样准确和兼容。

总蛋白定量分析

表一总结了常用的总蛋白定量分析方法。对于每种分析方法的兼容性，研究人员有必要评估检测样品的类型，检测范围和样本量，是否有合适的分光光度计，以及每个检测所需的时间和成本。

方法	吸收波长	机制	检测限	优点	缺点
紫外吸收光	280 nm	酪氨酸和色氨酸吸收光	0.1-100 mg/ml	样本量小，快速，成本低	不兼容去污剂和变性剂，变异高
二喹啉酸	562 nm	铜还原（Cu2+ 到 Cu1+）, BCA 与 Cu1+反应	20-2000 mg/ml	兼容去污剂和变性剂，变异低	低或不兼容还原剂
Bradford或考马斯亮蓝	470 nm	考马斯亮蓝染料和蛋白质之间形成复合物	20-2000 mg/ml	兼容还原剂，快速	不兼容去污剂
Lowry	750 nm	蛋白质还原铜, 铜-蛋白质复合物还原Folin-Ciocalteu	10-1000 mg/ml	高灵敏度和准确	不兼容去污剂和还原剂, 过程长

表一： 常用的总蛋白检测方法。

280 nm的紫外（UV）吸光值（范围：0.1-100 mg/ml）

因为芳香族氨基酸，酪氨酸和色氨酸，蛋白质在280nm有特征性紫外（UV）吸收光谱。 这通常被用来估计蛋白质浓度。苯丙氨酸和二硫键，在这个波长也有轻微的吸光度。这种方法很简单，而且因为新分光光度计在测量时采用了样品保留系统，所以需要的样品量很小。然而，蛋白质样品必须是纯的，不能包含具有相同吸收光谱的任何非蛋白质成分，例如核酸的污染 [1] 。这种方法是最快速的，但缺点是容易出错。

二喹啉酸（BCA）蛋白定量或基于铜的检测法（范围：20-2000 ug/ml）

二喹啉酸（BCA）法是Paul K. Smith于1985年在Pierce Chemical公司发明的。 该公司是BCA检测法的主要分销商 [2] 。BCA检测法和Lowry检测法都是基于Cu²⁺在碱性条件下转换为Cu¹⁺。这种转换被定义为双缩脲反应。该反应受四个氨基酸残基（半胱氨酸，胱氨酸，酪氨酸和色氨酸），以及多肽主链的影响。

图 1. BCA检测法的示意图表示

BCA 是Cu¹⁺的一种特定显色剂，在反应的第二步，两个BCA分子和一个Cu¹⁺离子发生反应。Cu²⁺被还原的数量是蛋白质浓度的函数，样品溶液的颜色变化成紫色，可以通过分光光度计测量在562 nm处的吸光度。吸光度与溶液中蛋白质的量是直接成正比的。 通过与已知蛋白标准，例如牛血清白蛋白（BSA）相比较，可估算蛋白含量 [1, 3, 4] 。

在一定范围的离子和非离子型去污剂如NP-40和Triton X-100，变性剂如尿素和盐酸胍，不会干扰BCA分析法，但往往会干扰Lowry等其他蛋白比色测定法（表二） [4] 。某些化学分子，例如还原糖，会干扰BCA分析法。可以通过几种措施消除或减少这些干扰的影响，例如通过透析，凝胶过滤去除干扰物质，或者如果蛋白的浓度足够高，可以通过稀释样品。

NP-40	蔗糖
Emulgen	甘氨酸, pH 2.8
HEPES	葡萄糖
DTT	EDTA
Triton X-100	NaCl
尿素	NaOH
盐酸胍	硫酸铵
醋酸钠, pH 5.5	SDS

表二：BCA蛋白检测的兼容性。

Thermo Fisher Pierce 最近新推出了改进的Pierce BCA 蛋白检测法，可以兼容还原剂如二硫苏糖醇（DTT），2-巯基乙醇（BME），TCEP和其他二硫键还原剂 [5] 。 BCA检测法是最敏感的蛋白定量法之一（检测下限达到5 ug/mL），变异低于其他方法（Bradford法），而且可以测量的蛋白质浓度范围很宽。

Bradford或考马斯亮蓝蛋白测定（范围：20-2000 ug/ml）

Bradford方法最初是Dr. Marion Bradford 于1976年定义的。是测量蛋白质浓度的最常用方法之一。原理是考马斯亮蓝G-250染料和溶液中的蛋白质结合形成复合物。未结合的染料，有四种不同的离子形式。较蓝的阴离子形式和蛋白质结合，在590 nm处有吸光度。蛋白质浓度可以通过测定蓝色离子形式染料的量，通过分光光度计测量溶液在595 nm的吸光度 [6] 。染料主要是结合于蛋白质的精氨酸，色氨酸，酪氨酸，组氨酸，苯丙氨酸残基 [1] 。

图 2. Bradford 检测法的示意图表示

大多数研究人员使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白，主要是因为BSA价格低廉，容易获得，但它并不总是合适的。事实上，BSA作为标准蛋白的缺点之一就是它与染料的结合反应很强，可能导致低估样本蛋白质含量。根据样品蛋白质的类型，可以使用免疫球蛋白G（IgG）或溶菌酶等??其他标准蛋白 [6] 。

Bradford法的一个优点是可以兼容溶液中用于稳定蛋白质的还原剂，而Lowry法不能兼容还原剂，BCA法在一定程度上也不能兼容还原剂。 Bradford法的局限是不能兼容通常用来溶解膜蛋白的低浓度去污剂。然而，可以通过凝胶过滤，透析，或磷酸钙沉淀蛋白质，以除掉去污剂 [6] 。Bradford法的另一个优点是可以检测高分子量（MW）的蛋白质，因为染料不结合低分子量的多肽 [1, 6] 。

在一般情况下，Bradford法是一种快速，准确的测量蛋白质浓度的方法。因此，Bradford法是蛋白质定量检测的最常用方法之一。

Lowry蛋白检测（范围：10-1000 ug/ml）

Lowry法是Oliver H. Lowry 于1951年提出的，基于两个化学反应。第一个反应是在碱性条件下铜离子的还原，与肽键形成复合物（缩二脲反应）。第二个反应是铜-肽键复合物对Folin-Ciocalteu试剂的还原，致使溶液的颜色变成蓝色，通过分光光度计在650至750nm 的范围检测吸光值 [1] 。使用选定的标准蛋白溶液，例如BSA的标准曲线，估算样品的蛋白含量。

图 3. Lowry 检测法的示意图表示

Lowry法的优点在于其灵敏度，最重要的是准确性高。但是，Lowry法比其他检测法所需的时间更长，而且蛋白制备缓冲液中常用的许多化合物（例如，去污剂，糖类，甘油，甘氨酸，EDTA，Tris）都干扰Lowry法并形成沉淀（表三） [1] 。尽管如此，只要蛋白浓度足够高，就可以通过稀释样品，从而减少这些化合物的作用 [7] 。此外，已经证实通过提高温度或使用微波炉，Lowry法所需的时间就能缩短 [7] 。

去污剂	二硫键化合物
糖类	酚
甘油	Uric acid
Tricine	鸟苷
EDTA	黄嘌呤
Tris	镁钙
钾化合物	巯基化合物

表三： Lowry 蛋白检测: 干扰物质。

针对特定蛋白的定量检测

许多实验的一个关键步骤是溶液中特定蛋白的定量分析。有几种方法可以使用。常用的方法是酶联免疫吸附试验，免疫印迹分析和质谱。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附试验（ELISA）是溶液中特定蛋白定量的一种常用方法。通常是在96孔板上进行的。关键步骤是特定抗原/蛋白的固定。具体来说，ELISA有不同变种。直接或间接ELISA，是特定抗原/蛋白直接吸附到检测板。封闭未被抗原包被的孔板表面，然后在孔板中加入酶标（直接ELISA）或未酶标（间接ELISA）的第一抗体，在测试孔板中，一抗与抗原/蛋白相结合。

对于未酶标的第一抗体，加入酶标的第二抗体与第一抗体结合。最后，加入酶底物（通常，四甲基联苯胺-TMB或碱性磷酸酶-AP），溶液发生颜色变化，使用分光光度计检测。颜色变化与蛋白质浓度是直接相关的。ELISA常用的一个变种是夹心ELISA，也就是说，特定抗原/蛋白结合在孔板表面包被的第一抗体（捕获抗体）和酶标的第二抗体（检测抗体）之间。

直接ELISA的优点是速度快，并且没有第二抗体的交叉反应问题，但局限是，第一抗体的标记可能是费时和昂贵的。此外，信号放大是最弱的。因此，间接ELISA是更常用的，因为可以从公司买到各种各样的第二抗体，最重要的是灵敏度提高了。然而，可能会发生第二抗体的交叉反应。最后，任何ELISA测定蛋白质浓度的一个重要环节都是蛋白质标准曲线，通常是连续稀释已知浓度的蛋白质，从而绘制标准曲线。

免疫印迹分析

免疫印迹只能半定量。通过凝胶电泳把原始或变性的蛋白质分开。把蛋白质转膜（硝酸纤维素或polyvinylidene-PVDF），然后使用特定的酶标抗体检测。最后，加入适当的底物（化学发光底物）产生可检测的信号。虽然免疫印迹比ELISA更费时，但是免疫印迹不仅可以对特定的蛋白进行定量，而且可以在一次实验中同时检测蛋白质修饰。

蛋白质质谱

蛋白质质谱是蛋白质定量的新兴方法。在蛋白质组学分析中，除了蛋白定性之外，一个重要的步骤就是对特定的蛋白的定量。质谱蛋白定量的方法有很多。常用的方法，较重的稳定同位素碳（13C）或氮（15N）加入到第一个样本（多肽或蛋白质），而相应的轻同位素（12C和14N）加入到第二个样本（内标），然后混合这两个样本进行分析。由于两个样本的质量差，用质谱分析仪测定的两个样本峰强度的比值，就相当于其相对丰度比。质谱蛋白定量的第二种方法，可以不用标记样本（即用基质辅助激光解吸/电离 - MALDI分析）。这里，我们要强调的是，使用质谱这种通用方法就可以在一次实验中同时定量和定性检测。然而，这种方法需要的检测仪器可能不是任何实验室都能买得起，这可能就限制了这种方法的使用 [3, 8] 。

总蛋白检测的文献

Thermo Fihser Pierce公司 和 Bio-Rad 实验室是总蛋白检测试剂的主要供应商（表四）。

BCA	116
		Thermo Fisher Pierce	103
		Sigma	7
Bradford	60
		Bio-Rad	44
		Thermo Fisher Pierce	8
Lowry	18
		Bio-Rad	17

表四：总蛋白检测在文献和主要供应商的统计（引用该试剂盒或供应商的文献数目）。

BCA 检测法

几乎所有的BCA蛋白检测试剂都是Thermo Fisher Pierce提供的，BCA 检测法就是该公司的一名科学家在许多年前发明。Thermo Fisher在数年前收购了Pierce。Thermo Fisher Pierce BCA 检测法，用于研究甲状腺癌 [9] ，在细胞分裂中VLDLR的作用 [10] ，S100A4蛋白翻译后修饰 [11] ，hnRNP H 蛋白和 hnRNP F蛋白作为FGFR2（成纤维细胞生长因子受体2）的沉默子 [12] ，子宫内膜异位症中StAR和芳香酶活性增加的机制 [13] ，细胞粘附和铺展中肝素酶（heparanase）的作用 [14] ，经过VES-处理的PC-3人类前列腺癌细胞中NAG-1表达的调控和作用 [15] ，在感光细胞功能中IGF-1R的作用 [16] ，在成骨细胞-破骨细胞的耦合中 Dlx5的作用 [17] ，以及许多其他研究  。微量BCA蛋白检测试剂盒被用来研究osteopontin在鸟蛋壳腺和蛋壳的免疫细胞化学定位 ，研究大鼠控制皮层撞伤(CCI)后的恢复 ，丙肝病毒核心蛋白的膜定位和病毒扩增 。

Sigma BCA 试剂和Bio-Rad BCA蛋白检测试剂盒也被文献引用。

Bradford 检测法

Thermo Fisher Pierce 也是Bradford 检测试剂盒的主要供应商之一。Pierce Biotechnology Coomassie/Bradford 检测试剂盒被用于研究伴侣蛋白ERp29的表达 ，YKL-40在调节碱性成纤维细胞生长因子的生物活性中的作用 ，以及其他的研究课题 。

Bio-Rad Bradford 蛋白检测试剂盒被许多文献引用。

其他供应商也提供了Bradford检测试剂盒，例如， Expedeon 和 Sigma 。

Lowry 检测法

Pierce Lowry assay (catalogue number 23240) 被用来定量蛋白浓度和Bio-Rad Laboratories Lowry assay被文献引用。