上海市临床检验中心 冯仁丰
摘要：糖化血红蛋白A1c（HbA1c）是诊断糖尿病和监测其治疗效果的重要指标。在国际临床化学与检验医学联合会（IFCC）定义了HbA1c的被测量之后，经过各方的努力，全球各临床实验室HbA1c检测结果间的差异正逐步减小。所有提供HbA1c检测产品的厂商都不会客观地描述自己产品的弱点，只会强调其优点和临床价值。面对HbA1c检测的现状，临床实验室必须充分了解每个产品的特性及其不足之处，在将产品用于临床检测前必须验证产品的分析性能。只有确认其分析性能能够用于临床检测时，才能使用。一个实验室内必须具备2种不同检测方法的产品，这样才能识别患者样品内有无异常血红蛋白。目前，尽管人们认为免疫学方法检测HbA1c时无异常血红蛋白的干扰，但国际上尚未从临床上对各种异常血红蛋白的影响作出客观的判断。为了患者的利益，临床实验室一定要充分了解更多的信息。
关键词：糖化血红蛋白；标准化；准确度
（上接本刊2016年第5期）
六、HbA1c检测准确度的现状
1968年，RAHBAR等[1-2]首次发现糖尿病患者HbA1c升高。40余年以后，HbA1c已成为糖尿病诊断和治疗一个不可或缺的指标。自从DCCT、UKPDS等临床试验开展以来，HbA1c检测的标准化工作获得了相当大的进展，明确了糖尿病患者血糖控制（由HbA1c检测确定）与其并发症之间的关系[3]。
由于HbA1c检测方法的发展，各大厂商在其产品特点和检测准确度宣传上有很多针对异常血红蛋白影响HbA1c检测结果的介绍。尤其是我国，在厂商刻意夸大宣传的情况下，临床实验室对其产品优点和缺点的了解很模糊。其实，任何一个检测方法都有其特点和优点，也一定有不足之处。
（一）血红蛋白病
血红蛋白病是由于血红蛋白分子结构异常（异常血红蛋白病）或珠蛋白肽链合成速率异常（珠蛋白生成障碍性贫血，又称地中海贫血）所引起的一组遗传性血液病。
1.血红蛋白血红蛋白是一种结合蛋白，相对分子质量为64000，由珠蛋白和血红素构成。血红素由原卟啉和亚铁原子组成。1个珠蛋白分子有2对肽链。一对是α链，由141个氨基酸残基构成，在氧运输中具有重要的生理作用；另一对是非α链，有β、γ、δ、ξ（结构与α链相似）及ε链5种。1条肽链与1个血红素连接，构成1个血红蛋白单体。人类血红蛋白是由2对（4条）血红蛋白单体聚合而成的四聚体。不同类型的血红蛋白其珠蛋白结构略有不同，但血红素均相同。
2.正常人出生后的3种血红蛋白正常人出生后有3种血红蛋白：（1）HbA。由1对α链和1对β链组成，即α2β2，是正常人主要的血红蛋白，占血红蛋白总量的95%以上。在胚胎2个月时HbA即有少量出现，出生时HbA占血红蛋白总量的10%～40%，出生6个月后即达成人水平。（2）HbA2。由1对α链和1对δ链组成，即α2δ2，出生后6～12个月起产生，占血红蛋白总量的2%～3%。（3）HbF。由1对α链和1对γ链组成，即α2γ2，出生时占体内血红蛋白总量的70%～90%，之后逐渐减少，至出生后6个月，其浓度降至血红蛋白总量的1%左右。
3.血红蛋白的基因血红蛋白不同的肽链由不同的遗传基因控制。珠蛋白基因突变使肽链的单个或多个氨基酸替代或缺如，导致珠蛋白分子结构改变，称为异常血红蛋白（或血红蛋白变异体）。全世界范围内经结构分析证实的异常血红蛋白日益增多，至20世纪90年代初期已达600多种，但仅不到1/3的异常血红蛋白会出现临床症状。据世界卫生组织估计，全球约有1.5亿人携带血红蛋白病基因，因此，已将血红蛋白病列为严重危害人类健康的6种常见病之一。我国云南、贵州、广西、新疆等地异常血红蛋白病发病率较高，现已发现异常血红蛋白67种，包括α链（34种）、β链（26种）、γ链
（4种）等异常，其中19种为我国首次发现。地中海贫血多发于我国华南及西南地区。根据近10年来我国28个地区近100万人口的普查资料，异常血红蛋白病的发病率为0.33%，α-地中海贫血的发病率为2.64%，β-地中海贫血的发病率为
0.66%。
4.异常血红蛋白对HbA1c检测的影响血红蛋白中HbA约占98%，HbA1c也在HbA中，而其他正常血红蛋白中没有能被糖化的β链。如果糖尿病患者合并血红蛋白病，其产生的各种异常血红蛋白会被糖化，影响HbA1c的检测，其异常的蛋白结构也会对HbA1c的检测造成影响。
（二）NGSP标准化和IFCC标准化
如前所述，ADA为了确定控制糖尿病患者的血糖是否可以减少糖尿病并发症的发生，在当时缺乏HbA1c参考物质和参考方法的情况下，采取了标准化措施，得到了全世界第1个糖尿病方面的结论，即对糖尿病的控制可以减少或减缓糖尿病并发症的发生。美国为了将研究成果在美国国内和全世界范围内应用，实施并推广了NGSP，使全世界的HbA1c检测结果统一以百分值（%）表示。NGSP采用HPLC层析技术分离HbA1c，但现已被证实其分离的HbA1c不是单一蛋白。而IFCC既有参考物质，又有参考方法，对HbA1c的标准化非常完整。因此，ADA认定IFCC的HbA1c参考系统为全球唯一的参考系统，并且承认美国的NGSP结果可上溯至IFCC的参考物质和参考方法。这在以往任何领域都从未有过。但不可否认的是美国NGSP对全世界HbA1c检测的影响很大，伯乐（Bio-Rad）等专注于HPLC离子交换技术的公司多年来在HPLC技术上有了很大的改进。IFCC实施的HbA1c标准化尽管晚了几年，但IFCC对HbA1c标准化的贡献是前人在这个领域从未有过的。为了使IFCC的成果尽快在临床上得到应用，各大厂商已经开发出免疫学方法和酶法产品用于临床实验室检测HbA1c。这些方法可以直接报告IFCC结果。由于支持IFCC开展参考方法和参考物质研究并形成相应检测方法的厂商几乎是同一家，所以其在推广免疫学方法的产品时，强调免疫学方法的HbA1c结果可直接溯源至IFCC参考系统，而且不受任何异常血红蛋白的影响；同时指出HPLC无法避免异常血红蛋白的干扰。
在国内市场上，报告NGSP结果的产品厂商和报告IFCC结果的产品厂商竞争非常激烈。尤其是检测方法能否特异地消除异常血红蛋白干扰是各大厂商竞争的重点。尽管国际上认为NGSP和IFCC结果均有效，但这已影响到临床实验室对HbA1c结果的解释。
（三）对HbA1c常规检测方法的分析
1.以往HbA1c检测出现差异的原因在IFCC对HbA1c的被测量进行定义前，任何血红蛋白被糖化的形式都是糖化血红蛋白的1个组分，导致糖化血红蛋白在定量检测上非常混乱。以正常的血红蛋白为例，在血红蛋白上有多个游离氨基，这些游离氨基均可被葡萄糖糖化，而且在糖化过程中，游离氨基是被随机糖化的，糖化可发生在血红蛋白β链N端的第1个氨基酸[缬氨酸（β-N-Val-1）]，也可以在β链第17个、第20个和第66个赖氨酸（β-Lys-17、β-Lys-20、β-Lys-66）的ε氨基，又或在α链N端的第1个氨基酸[缬氨酸（1α-N-Val-1）]、α链第7个和第16个赖氨酸的ε氨基上。在上述7个可以被葡萄糖糖化的位点上，被糖化的任意一个位点或各个糖化位点的任意组合是导致各种检测方法出现差异的原因。另外，异常血红蛋白上还有其他可糖化的位点。
2.IFCC的HbA1c定义为了使糖化血红蛋白检测标准化，IFCC对糖化血红蛋白进行了定义：β链N端的缬氨酸被糖化的血红蛋白称为糖化血红蛋白（即HbA1c）。β链上其他位点以及α链上的位点被糖化的血红蛋白均不认可为糖化血红蛋白。IFCC在充分考虑了糖化血红蛋白分子结构复杂性的基础上第1次明确了HbA1c的定义。只有硬性规定了某个分子结构为“HbA1c”，才能使HbA1c的检测结果在全球具有可比性。但不能否认的是没有被IFCC定义的糖化血红蛋白是客观存在的。HbA1c在检测量值上实现了全球的可比性，却使临床遗漏了已经发病的糖尿病患者血液中其他分子结构的糖化血红蛋白。因此，在糖尿病患者诊断和疗效监测中，采用免疫学方法检测HbA1c出现了明显的临床问题[4]。
3.HbA1c的常规检测方法（免疫学方法和酶法）由于常规检测方法的限制，IFCC参考方法将未糖化的血红蛋白定义为N端缬氨酸未被糖化的β链血红蛋白。但在常规检测中，一般方法难以分离出未被糖化的β链血红蛋白。因此，临床实验室还是沿用了传统的检测血红蛋白的方法，以比色法检测样品中的血红蛋白，以“红色”程度来表示血红蛋白总量。这个方法检测出的是样品中所有含有高价铁离子的血红蛋白，除包括正常的α、β、γ、δ、ξ及ε链之外，还有各种异常血红蛋白中的各种链。这与IFCC对HbA1c定义中未糖化血红蛋白仅仅是β链血红蛋白的要求完全不同。因此，HbA1c计算公式中的分母在无形中被放大了。如果免疫学方法使用的抗体完全符合IFCC对HbA1c的定义，那么最后得到的HbA1c结果会偏低。因此，在HbA1c免疫学检测方法开始应用时，有学者认为检测方法受到了干扰[5]。RHEA等[5]介绍了识别HbAβ链N端糖化氨基酸结构的HbA1c免疫学定量检测方法。他们在文章中写到：第1代免疫学检测试剂中的抗体针对的抗原决定簇主要分布在血红蛋白β链的第4～10个氨基酸，包含了第6个可被改变并形成异常血红蛋白[血红蛋白S（HbS）和血红蛋白C（HbC）]的氨基酸位置。正是因这些异常血红蛋白的存在，HbA1c检测受到了干扰，这也促进了第2代免疫学检测试剂的发展。第2代试剂使用的抗体包含了血红蛋白β链第1～4个氨基酸，因此极大地消除了来自HbS和HbC的干扰，与第1代检测试剂相比，其准确度明显被改善。第2代免疫学检测试剂的抗体通过结合类似于HbA的HbS和HbC，为具有杂合子的患者提供了临床上有用的HbA1c检测值，而他们的RBC寿命基本上是正常的。这篇文章的解释让人疑惑。使用了与IFCC参考方法中检测β链N端的六肽对应的抗体，检测的是第4～10个氨基酸的多肽链，应与IFCC参考方法一致，为什么会出现“干扰”？原因在于IFCC充分考虑到异常血红蛋白在蛋白结构上的突变多发生于HbAβ链N端起的第6个氨基酸，因此其HbA1c参考方法只检测β链N端起的六肽。正常的HbAβ链N端的6个氨基酸序列为Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-，HbSβ链N端的6个氨基酸序列为Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-，HbCβ链N端的6个氨基酸序列为Val-His-Leu-Thr-Pro-Lys-。互相比较可发现，HbA、HbS和HbC的第6个氨基酸不同。IFCC的专家非常注重此点，只切下了6个氨基酸多肽进行分析，消除了HbS和HbC对检测的干扰。经典的免疫学方法也遵循了这个特点，避免了HbS和HbC的干扰。但是，HbA1c计算公式中的分母采用了传统检测方法得到的血红蛋白值。由于传统检测方法测定了所有类型的血红蛋白，违背了IFCC对HbA1c的定义，因此分母的数字被放大，导致最后计算得到的HbA1c值缩小了，所以这个结果被说成是“受到了干扰”。而第2代免疫学检测试剂使用的抗体只针对β链N端第1～4个氨基酸的四肽。这样就回避了IFCC对β链N端第6个氨基酸为谷氨酸的要求。无论是哪种血红蛋白，只要具有类似HbAβ链N端的4个氨基酸，都能被检测出来。这样就放大了HbA1c计算公式中的分子。巧合的是HbA1c计算公式中的分母因检测了所有非糖化血红蛋白而放大，分子也因检测了各种类似的糖化血红蛋白而放大，二者放大后的数值相除，得到了与IFCC参考方法检测结果非常相似的数值。这样的巧合在某公司的资料上非常明确，其HbA1c计算公式为HbA1c=（HbA1c+HbX1c）/（总血红蛋白+HbX）。式中的分母是“总血红蛋白+HbX”，“HbX”为异常血红蛋白；分子是“HbA1c+HbX1c”，HbX1c是所有异常血红蛋白被糖化的部分。因此，HbA1c的免疫学检测方法在检测量值上可以溯源至IFCC的参考系统。但在实际检测中，不受任何异常血红蛋白影响的情况是不存在的。HbA1c酶法基本原理是首先由蛋白酶从血红蛋白β链N端处切下2个氨基酸的双肽，然后在几个酶的作用下水解，最后显色检测。酶法比免疫学方法更简练，只用2个氨基酸的小肽。酶法不需要考虑各种异常血红蛋白的结构，只要β链N端最后1个氨基酸为缬氨酸，不管是哪种异常血红蛋白，酶法均将其列为检测对象。因此，异常血红蛋白对酶法的影响很大。
（四）临床实验室HbA1c检测现状
从RAHBAR等[1-2]在电泳图谱上发现糖尿病患者有异常的血红蛋白起，无论是DCCT还是IFCC，均利用分离图谱对HbA1c进行定量检测。DCCT的实验室在层析分离图谱上观察到HbA1c峰，并结合未糖化的血红蛋白峰（同时加上HbA1c峰）计算出HbA1c的百分值。IFCC的HbA1c工作组提出的参考方法采用HPLC技术分离HbA1c和HbA0六肽，然后再进行定量检测。他们使用的也是HPLC的分离图谱。因此，临床实验室在检测糖尿病患者HbA1c时如果仅仅使用免疫学方法或酶法在自动化仪器上进行检测，虽然速度更快、成本更低，但HbA1c结果只有一个检测值，根本无法了解患者究竟有无异常血红蛋白。有学者借用SACKS等[4]的研究成果，认为：通过HPLC的分离图谱就可以看出HPLC分离方法的落后，有很多异常血红蛋白的分离峰掩盖了HbA1c的峰，因此HPLC根本无法消除所有异常血红蛋白对HbA1c检测的影响。从这篇文章可以看出我们的检验界同道并没有认真阅读Sacks的文章。
Sacks博士是著名的糖尿病专家，是他和其他DCCT专家共同完成了DCCT这项临床试验，得出了控制血糖与糖尿病并发症之间的关系。他们正是使用离子交换HPLC，采取强制标准化措施，得到了这个伟大的结论。NGSP参考实验室至今依然使用离子交换HPLC检测HbA1c。尽管NGSP将离子交换HPLC列为参考方法，但这些顶级专家早在21世纪初就已经以综述的形式告诫所有实验室：必须谨慎使用离子交换HPLC，千万不要将HPLC自动报告的结果直接发给临床，因为极有可能会因患者的异常血红蛋白掩盖了HbA1c而导致检测结果出现错误。必须先看HPLC的层析图，然后再考虑如何发出检测报告。如今，面对免疫学检测方法的强大优势，ADA的专家们很快接受了不受异常血红蛋白影响的免疫学检测产品[Tina-quantHbA1c产品（罗氏公司）]。尤其是在近2年的研究中，为了解异常血红蛋白对各种检测方法的影响，均将免疫学检测方法和硼酸亲和方法列为比较方法，这也充分显示了ADA明确的观点。
时至今日，很多临床实验室依然将离子交换HPLC作为检测HbA1c的首选。原因在于HPLC为每个患者样品提供了一张便于判断和使用的层析图。尽管免疫学检测方法在很多研究中被认为很少受到异常血红蛋白的干扰，但如果仅仅是一个检测数据，根本无法让实验室知道检测的样品中有无异常血红蛋白。
复旦大学附属中山医院检验科的做法非常值得学习。无论是为一致性计划的调查品定值，还是常规检测患者样品的HbA1c，他们均先使用离子交换HPLC进行检测，从层析图上先作出判断。一旦层析图显示HbA1c难以区分时，他们再采用免疫学方法检测，同时检测糖化白蛋白，结合糖化白蛋白结果和患者近期的血糖表现对患者的血糖状况和HbA1c结果作出判断。
罗氏公司cobas系列检测系统的HbA1c产品说明书写得非常好，其中写到：由于检测原理的问题，必须要谨慎解释各种异常血红蛋白值下患者的任何HbA1c结果。异常血红蛋白会影响红细胞的半衰期或体内糖化作用速度。在这些情况下，即便是分析上正确的结果也不能反映正常血红蛋白患者可预期的血糖控制水平。只要怀疑存在异常血红蛋白（如HbSS、HbCC或HbSC）影响HbA1c值和血糖控制之间的相关性，就不得使用HbA1c值来诊断糖尿病。
尽管大家都认为免疫学方法很少受异常血红蛋白的干扰，但ADA的导则明确指出：只要患者样品中具有异常血红蛋白，其HbA1c结果就不可随意报告给临床，不能作为糖尿病的诊断依据。由此可见，仅凭一个HbA1c检测值是不能看出患者样品中有异常血红蛋白的。因此，复旦大学附属中山医院的做法值得推广，他们的做法完全符合ADA导则的精神。建议临床实验室首先使用离子交换HPLC检测，发现问题后再采用免疫学方法进行检测。
在我国，越是南方地区，异常血红蛋白对糖尿病诊断的影响就越严重。目前，我国南方地区的人群不断流入全国各地，同时各地也出现了越来越多新的糖尿病患者，因此各地临床实验室应时刻注意异常血红蛋白对HbA1c检测结果的影响。
无论临床实验室采用什么方法检测HbA1c，均应认真了解异常血红蛋白对HbA1c检测结果的影响。尤其是在选择HbA1c检测产品时，一定要仔细阅读厂商提供的说明书，详细了解其分析性能。使用免疫学方法或酶法检测HbA1c的临床实验室最好另外再准备类似离子交换HPLC的产品，用于检测样品中有无异常血红蛋白。对于正在使用离子交换HPLC的临床实验室，应备有免疫学方法或酶法的产品。一旦在HPLC层析图上发现并确定为异常血红蛋白时，应使用其他方法进行比较，并及时与临床联系，检查患者的糖化白蛋白、近期使用血糖仪自我监测的资料和临床表现等，防止发出错误报告。
我国各地经济发展水平差异较大，一些经济欠发达的地区特别要注意患者营养不良、近期有出血或输血等情况，这些情况均会影响红细胞的寿命。对于这样的患者不应将HbA1c作为糖尿病诊断或治疗监测的指标，应采用糖化白蛋白、果糖胺以及直接葡萄糖检测等项目代替，以免作出错误诊断，延误治疗[4]。
七、总结
HbA1c是诊断和监测糖尿病治疗效果的重要指标。经过IFCC的努力，全球HbA1c检测结果的差异正逐步缩小。
所有提供HbA1c检测产品的厂商都不会客观地描述自己产品的缺点，只会强调其优点和临床价值。为了患者的利益，每个实验室必须完善检测质量管理。在将HbA1c检测产品用于临床检测前必须验证其分析性能。只有确认产品的分析性能能够用于临床检测时，才能使用。但我国的临床实验室在这方面至今做得很差，应引起各实验室的重视。
一个实验室内必须具备2种不同检测方法的产品，才能识别患者样品内有无异常血红蛋白。目前，尽管人们认为免疫学方法检测HbA1c时无异常血红蛋白的干扰，但国际上尚未从临床上对各种异常血红蛋白的影响作出客观的判断。为了患者的利益，临床实验室一定要充分了解更多的信息。大家还需要认真学习！
参考文献
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(本文转自检验医学2016年6月第31卷第6期)