饮用水中病原原生动物的危害一直受到国际社会的关注和重视。隐孢子虫（Cryptosporidium）和贾第鞭毛虫（Giardia）是其中的典型代表，也是研究最多的对象之一。它们在水中的存活时间相当长，且对环境因素和传统氯灭菌剂具有较强的抗性，可感染人类和动物,引起发烧、腹痛等症状，对免疫力低下或缺乏的患者甚至导致死亡。它们在城市供水系统中的存在直接威胁饮用水安全，并对城市水环境带来风险。因此，其检测工作受到学术界的关注，掌握它们的分布现状及处理方式和规律有重要意义。
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▲ 隐孢子虫的扫描电子显微照片 © Getty Images
近日德国科隆大学、青海大学畜牧兽医科学院“千人计划”入选者Panagiotis Karanis教授、澳洲University of Wollongong的Jerry Ongerth和日本带宏畜产大学的Artemis Efstratiou对这两种病原原生动物自上世纪70年代以来的检测方法学和技术的演化史进行了综述，报告刊登于2017年第123期的IWA期刊Water Research上。他们希望通过这篇综述，提高两虫还有其他水生原生生物寄生虫的检测能力，促进相关研究的进步。
Panagiotis Karanis是德国科隆大学教授，2014年被聘为国家“千人计划”专家，一直从事于病原生物学和医学生物技术方面的研究工作，在多种原生动物疾病病原的快速分子诊断方面具有非常高的造诣，特别是在水源性和食源性原生动物疫病的诊断方面。他所研究的水源中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的检测技术在国际上处于领先水平，与意大利、日本、德国等国的高校和科研机构有学术交流和合作。
Jerry Ongerth是澳大利亚University of Wollongong的博士后，此前在密歇根大学安娜堡分校获得市政卫生工程博士学位，随后的事业生涯一直从事水污染的研究，对于隐孢子虫和贾第鞭毛虫的研究，他甚至专门建立了网站，是目前这方面研究资讯最集中的门户网站之一 http://www.cryptosporidiumandgiardia.com
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欧洲 （2010年）和美国（2015年）的统计数据显示，贾第鞭毛虫病的致死率约每年6.8/100000，是隐孢子虫病的5倍（1.2/100000）。这些病原通过直接或非直接的粪-口途径传播，具体传播机制包括人与人、动物间传染、以及摄入受污染的水和食物。对地表水进行检测来判断隐孢子虫和贾第鞭毛虫的存在已经有很长的发展历史，最早可追溯到上世纪70年代，在这四十年间，这方面的检测技术无论是方法论还是技术设备都有了不少的发展。
这份综述报告的文献汇总来源为PubMeb和Web of Science。研究人员对两个数据库对相关关键词“水、隐孢子虫、隐孢子虫病、贾第鞭毛虫、贾第鞭毛虫病、寄生虫、水生原生生物”进行搜索，汇总报告超过600篇，并对检测的目标进行明确得到定义。当今使用的检测程序是要对两种目标生物隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫囊肿的特征进行识别，作者对检测技术定立了初步的条件，例如要能处理10L的样本量等。
美国上世纪60年代和70年代的肠胃炎病的爆发引起了人们对贾第鞭毛虫病的兴趣。美国环保署当时举行的贾第鞭毛虫病水传播研讨会是一个里程碑事件，相关部门开始开展贾第鞭毛虫的检测工作。但当时的知识储备和技术条件使得人们以为贾第鞭毛虫的存在是间隙性而且浓度很低，早期的研究者找到的问题所在，并建立了更有效的标准化检测程序。
美国环保署的第一部官方流程发布于1978年，最初是有美国疾控中心为检测腹泻疾病的病毒制定的。尽管当时人们就意识到一个回收率（RE- recovery efficiency）的问题，但并没有很好的对策，直到2000年才有干净的、预标签并且准确计数的可行方法，这大大提高了阳性对照的准确性。目前而言，美国EPA制定并发布的1623方法以及它2012年的新版（1623.1）是目前国际上常用的水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫标准检测方法，RE回收率分别由30-50%和40-60%，检测下限提高到0.2-0.5/L（10L样品），所以这篇综述也会用1623方法作为其他方法的比较基准。
上述的1623方法概括来说，取样方法有三步：
作者对三步使用的方法和技术进行会汇总，列成下表：
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▲ 表1 取样第一步的方法汇总
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▲ 表2 取样第二步的方法汇总
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▲ 表3 取样第三步的方法汇总
研究人员之后对每一步使用的方法趋势作图：
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▲ (a) 浓缩,(b) 提纯 (c) 检出 三步使用方法频率的历史变化趋势
图一的趋势图可以看出，滤芯过滤和膜过滤和离心是一开始就是用的浓缩方法，经过35年的推移，过滤的使用率已经占到72%，絮凝（10%）、离心(7%)和超滤（6%）是剩下的浓缩方法。因为其实用性和较低的专业度要求，滤芯过滤成为了两虫检测的第一步的首选。
提纯在1985年左右才成为检测程序的标准步骤之一，之前都是用密度梯度分离而已。在1997年免疫磁分离(IMS)引入之前浮选分离（flotation）和非连续梯度离心（discontinuous gradient centrifugation）是主要的提纯技术，1997年之后IMS逐渐成为使用率最高的方法（在2014年达到89%）。
而第三步检出方面，一开始的技术都是基于显微镜的：明视野和落射荧光显微镜。然后免疫荧光法（IFA）很快成为最流行的技术，直到2000年，诸如聚合酶链式反应PCR和相差显微镜(phase contrast microscopy)、流式细胞术（flow cytometry）等新技术的引入。
2000-2004年间，美国EPA的1622和1623方法的颁布使得很多研究论文都使用IFA、DAPI染色和DIC显微镜来做检出，或再与基于PCR的方法结合，而且至今没有太大的变化。因为只有这技术能提供大家认可的肠道原生动物的量化数据。
研究的时空分布
下图是作者对来自53个国家600多篇相关文献制作的信息图：
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结果显示，北美占了其中的36%，其次是欧洲（31%），亚洲第三（19%，主要为日本和中国），中南美洲和大洋洲各占7%和5%，剩下的非洲为3%。
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▲图3. 1975-2016期间的论文数的国家分布情况
从上述数据可以看出美国是最早开始这方面研究的国家，研究报告的数量也是最多的，而很大一部分是因为1993年密尔沃基隐虫水质事件之后政府和水行业的资金投入。而进入2010年之后，亚洲成了主要的贡献地区，例如日本和韩国。而中国则是一个新的研究增长区域，它为两虫在非西方国家的生长的动力学变化情况提供了新的信息。
1623方法
作者说虽然1623方法是目前常用检测方法，但它存在着耗时、工作量大、成本高、回收率（RE）低等问题。他们说目前两虫检测方法的研究报告的地域间的差别，很大程度上也是因为1623方法的这些缺点使然。要在发展中国家推广和普及两虫的检测，开发新的更经济实惠的替代方法是十分必要和关键的。这样我们才能获得两虫在更清晰的全球分布情况。
回收率
作者们一再强调，准确测量的回收率是对不同样品的生物浓度进行比较的前提。但目前很多文献里对两虫的浓度都用“密度”来描述，大多忽略了回收率，这是不完整的。这使得相关研究实际上需要额外的人力物力去补全数据，而且没有考虑回收率的研究很难对数据做分析，而且往往得到误导的结论。作者提议使用同一的计算方法来解决这一问题。
原生动物、水和食物
作者最后说，对于水与食物在隐孢子虫病和贾第鞭毛虫病的传播的作用，大家已经有比较清楚的认识了。但是因为这些个体分离的难度，目前可用方法依旧十分昂贵和有难度，另外它们在诊断性实验室的使用也依旧有限。而常规的检测方法，例如1622和1623方法，并不能对基因型和其子类型进行识别，这使得水务局无法从检测结果中得到实质性的具体信息。
限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术，与显微镜技术相比，检测内容更有针对性，但也不能对感染和非感染性卵囊和孢囊进行区分，而且经常受到一些抑制剂影响。所以需要更加有效的分子学方法来使DNA的提取最大化，使PCR抑制剂的影响最小化。
将上述问题一并考虑，多层屏障系统 (保护水源、完整的污水处理)仍然是目前最能广发应用的减少和控制水生疾病传播的方法。精准检测方法是环境性寄生虫的诊断和安全饮用水应用技术的表现评估的关键所在。
作者最后总结道：虽然过去40年里，关于对研究对象的认识以及检测技术工具都得到了显著的改善，我们实际上还没找到最有效的方法。如果仅仅对文献做总结，大家可能简单地认为标准和方法的统一能满足不同的应用，但作者指出这个观点是有缺陷的，根据他们自己的经验，并不存在普适的方法满足所有的检测需求。采样和检测分析的细节需要根据实际的水质进行调整。例如浊度低的地表水，使用膜过滤结合IMS和IFA的方法能获得比其他方法更好的检测结果。这还是需要检测人员要具备相应的知识来因地制宜。同时作者认为在未来十年就能实现简易的在线实时隐孢子虫和贾第鞭毛虫的检测并不现实。
参考资料
Artemis Efstratiou a, b, Jerry Ongerth a, c, Panagiotis Karanis, Evolution of monitoring for Giardia and Cryptosporidium in water, Water Research, 123 (2017) 96-112, http://dx.doi.org/10.1016/j.watres.2017.06.042
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