【原创】如何正确鉴定临床标本中的细菌

2022-03-30 14:01:23

第一节：菌落观察与涂片染色

微生物自动分析仪的使用弥补了传统细菌学鉴定的薄弱环节，但是细菌的菌落观察、涂片染色等仍不可缺少，在细菌鉴定中起到导向和领航的作用，二者结合可提高细菌鉴定的准确性。

一、菌落特征

细菌的菌落、色素、溶血性、气味等特性是细菌鉴定的重要依据。如葡萄球菌在血琼脂平板上的菌落直径大于链球菌；普通变形杆菌、奇异变形杆菌、潘氏变形杆菌在血平板上均呈蔓延生长；铜绿假单胞菌菌落扁平，边缘锯齿状，具有生姜味，产生绿色素，有金属光泽；

1.细菌的色素红色素(粘质沙雷菌)，紫色素(紫色杆菌)、黄色素(聚团肠杆菌、板畸肠杆菌、脑膜败血伊丽莎白菌、黏金黄杆菌等)、橙红色素(红球菌)等可缩小鉴定范围；

2.菌落的形状黏液型如克雷伯菌、铜绿假单胞菌（部分）、大肠埃希菌（部分）、鲍曼不动杆菌（部分）、放射根瘤菌，表面颗粒状(结核分枝杆菌、诺卡菌)，呈蜡样(蜡样芽孢杆菌) 等,这些对细菌的鉴定提供了重要的价值。

二、形态学鉴定

形态学在细菌鉴定中非常重要，通过涂片染色结果判断细菌的革兰染色属性，观察细菌的形态大小和排列方式，初步判断细菌种类。形态学鉴定是细菌鉴定的前提，染色不佳或误判会对细菌鉴定易产生错误的导向。

1.革兰阳性球菌如发现短链、长链状、成双、成单等排列，拟考虑为链球菌属；见到矛头状排列的革兰阳性双球菌（有时呈单个、短链状）拟考虑为肺炎链球菌，这种细菌很容易误认为是革兰阳性杆菌，此时，不仅要注意细菌的单个形态，更要注意细菌的整体排列状态；镜下形态为革兰阳性球菌葡萄状成堆、成双、成单等短链排列，可能为葡萄球菌属；肠球菌呈链状排列、菌体顺链方向延长，一般为3～5个一列；如发现革兰阳性、菌体为丝状、成团、分支菌丝，应怀疑放线菌或诺卡菌。

2.革兰阴性球菌如肾形成双排列时，疑似脑膜炎奈瑟菌。血培养一般比较少见，常见于脑膜炎，判断要结合脑脊液的培养结果。此类细菌在涂片中较肥大，一般为散在排列，需与不动杆菌相鉴别。而男性患者在泌尿生殖道标本涂片中见到肾形的革兰阴性双球菌分布于白细胞内外，可初步诊断为。

3.革兰阳性杆菌革兰阳性杆菌形态分为大杆菌和小杆菌。如发现革兰阳性粗大杆菌，有芽孢，两端钝圆，应考虑枯草杆菌。见到革兰阳性，菌体一端或两端呈棒状，不规则，栅状等排列，疑为棒状杆菌。而小杆菌短小，观察时要注意排列方式，易与肺炎链球菌相混淆。小杆菌在考虑棒状杆菌同时，注意李斯特菌和红斑丹毒菌。

4.革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌形态多样，呈长杆菌、球杆菌以及弧形杆菌。肺炎克雷伯菌形态粗短，有时会有荚膜；假单胞菌形态细长；不动杆菌属和莫拉菌属呈革兰阴性球杆菌样，需要与革兰阴性球菌相区别。如在巧克力平板涂片镜检发现革兰阴性小杆菌，则怀疑是流感嗜血杆菌、布鲁氏菌呈革兰阴性球状、球杆状或小堆。。另外破裂细胞的碎片也多为革兰阴性，应注意与革兰阴性短小杆菌区别。

5.真菌涂片革兰染色为革兰阳性酵母状，圆形或椭圆形，有时会出现较多的假菌丝,相互结交成团，可能为白念珠菌、新型隐球菌等其他酵母样真菌。在脑脊液中发现疑似真菌，应加做墨汁染色，注意新型隐球菌可能。

第二节：细菌生化鉴定

一、革兰阳性菌的鉴定

根据血琼脂平板菌落大小、颜色、溶血等特征，涂片染色，镜下形态确定其为革兰阳性球菌还是革兰阳性杆菌，若为革兰阳性球菌则先做触酶试验，区分葡萄球菌属与链球菌属，触酶阳性菌落做凝固酶试验，同时做玻片法及试管法（测定结合凝固酶和游离凝固酶，都阳性初步判断为金黄色葡萄球菌，可区别于施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌），并选择革兰阳性鉴定卡上机鉴定。对于革兰阳性杆菌则选择棒状杆菌板条，并做触酶试验。

二、革兰阴性杆菌的鉴定

根据麦康凯平板菌落分为无色（乳糖不发酵）和红色（乳糖发酵），在血琼脂平板挑取菌落作氧化酶试验进行初步分类，确定其是肠杆菌科细菌、非发酵菌、弧菌科细菌还是其他菌，选择相应的革兰阴性鉴定卡上机鉴定或进行传统生化反应。次日仪器报告细菌鉴定结果，需再次观察原始平板上的菌落特征，判断其结果与仪器结果是否相吻合，如果相吻合时，才可以发出报告。

值得注意的是有些检验人员在细菌鉴定时过度依赖于仪器，完全根据仪器鉴定的结果报告。实际上机器有时也会出现鉴定错误，例如曾经发现仪器鉴定为摩根摩根菌，对照原始平板发现麦康凯平板上为粉红色菌落，与仪器鉴定结果不符，重新涂片为革兰阴性球杆菌，进一步鉴定最终为鲍曼不动杆菌。有时同一种细菌在不同的机器上会出现不同的结果，所以在细菌鉴定过程中应结合平板上的菌落特征和形态染色，才能获得正确的结果。

三、少见、疑难菌株的鉴定

临床标本培养分离出的细菌绝大多数能鉴定到种，但也有极少数细菌无法被鉴定，对于这种情况，首先要结合临床和实验室的情况确定其是否为致病菌。

1、血培养中少见、疑难菌株

血培养仪器阳性报警后，有时革兰染色镜下未能查见细菌，不能以此就判断标本中无细菌，因为有些细菌与染色液沉渣混在一起，不易辨别，可以采用作者推荐的方法（瑞氏染色），重新取阳性血培养瓶内的肉汤涂片并用瑞氏染色。在瑞氏染色涂片中易查见形态清楚的、着紫色的病原菌，以排除假阴性的可能。但是瑞氏染色涂片不能辨别病原菌的革兰染色属性，可根据革兰染色背景判断是革兰阳性菌还是阴性菌。
有时血培养仪器阳性报警后，革兰染色涂片查见细菌，但转种血琼脂平板、巧克力平板等多种固体培养基未见细菌生长，应怀疑少见菌，可采用下列方法：
1．转种可重新转种含有维生素B6、半胱氨酸及营养成分高的血琼脂平板。
2．卫星试验将血培养瓶肉汤转种至血琼脂平板上，然后交叉划线接种金黄色葡萄球菌，在金黄色葡萄球菌菌落周围观察有无“卫星现象”（靠近金黄色葡萄球菌菌落周围生长，远离金黄色葡萄球菌不生长）。葡萄球菌和卫星状生长区外围有30mm直径的特大透明溶血圈，而苛养菌生长区基本不溶血，仅菌落旁有半透明β溶血。
3．作者推荐用血培养瓶肉汤配制琼脂平板取未用血培养瓶肉汤20mL加琼脂粉0.24g,灭菌、消毒、冷却（加5%羊血或不加）制成平板（配置好的平板和血培养瓶内的营养成分相一致，使阳性瓶中的细菌在此平板上生长）。
4.延长培养时间，置放二氧化碳孵育箱对于分离一些生长缓慢,营养要求苛刻的革兰阴性杆菌(如嗜沫嗜血杆菌、人心杆菌、伴放线杆菌、啮蚀艾肯菌、金氏金氏菌、军团菌属、巴尔通体、二氧化碳噬纤维菌和布鲁菌属等) ,应延长培养至2～4 周,然后传种特殊培养基,置放二氧化碳孵育箱培养。
有时血培养标本中，尽管采取了以上种种措施，仍有极少数细菌无法被鉴定，首先应确定其是否为致病菌。如两瓶或两套血培养标本培养出同一种细菌，临床症状符合细菌感染，则可认为是致病菌，可以在鉴定结果出来之前先行直接药敏试验。

2、开放性标本罕见、疑难菌株

痰、尿、伤口分泌物等开放性标本遇到难以鉴定的细菌，不能随意丢弃，或模棱两可的报告，应通知临床，重新留取标本，需连续三次鉴定出同一种细菌，然后结合临床和实验室结果确定是否为致病菌。若为致病菌，应根据细菌的镜下形态和革兰染色结果进行药敏试验，尽快将药敏结果报告临床，在药敏报告上注明该细菌需进一步鉴定（菌名待报），继续进行下一步鉴定。

三、鉴定

鉴定必须按照科-属-种程序进行鉴定，若是革兰阴性杆菌，可根据氧化酶、触酶、动力、葡萄糖O-F等试验进行鉴定；若是革兰阳性球菌，选择触酶、凝固酶、胆汁七叶苷、CAMP试验、葡萄糖O-F等试验；若是革兰阳性杆菌，选择触酶、葡萄糖O-F、胆汁七叶苷、蔗糖、木糖、甘露醇和硝酸盐等试验分别进行鉴定到属。若仍无法鉴定到科、属、种，则可将标本送到上级实验室或通过分子生物学方法做进一步鉴定。

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