本文介绍了全转录组项目（mRNA、miRNA、LncRNA、circRNA等）RNA样本相关概念、送样要求、检测方法、RNA 样本文库构建风险及样品处理注意事项等。
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相关概念：
1) RIN：RNA Integrity Number，RNA 分子完整性指数（从 0-10），直接反应了 RNA 质量的好坏，此数值越大表明 RNA 质量越好越完整。。
2) 28S/18S，23S/16S：反映 RNA 完整性，如果 28S/18S（真核生物）或 23S/16S（原核生物）
比值为 1.2，表明所提取 RNA 完整性较好。
3）评判样本 RNA 提取的是否完整，要同时考虑 RIN 值，28S/18S 和 aligent2100 检测峰图基线是否平整来进行综合判定。
4）OD260/280，OD260/230：微量分光光度计检测相应比值，反映 DNA/RNA 纯度。核酸在 260nm 波长处有最大吸收峰；OD280 用来评估蛋白残留污染。
OD230 来评估 RNA 样品中是否存在碳水化合物、多肽等有机污染物。
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注：节肢动物类不要求28S:18S≥1.2
图：RNA送样要求（例）
样本一般检测方法：
1）1％ 的琼脂糖电泳检测 RNA 样品是否有降解以及杂质污染；
2）NanoPhotometer® 分光光度计检测样品的纯度和粗浓度（IMPLEN, CA, USA）；
3）Qubit® 3.0 Flurometer（Life Technologies, CA, USA）检测 RNA 样品准确浓度；
4） Agilent 2100 RNA Nano 6000 Assay Kit （Agilent Technologies, CA, USA）检测RNA 样品是否完整性。
RNA 样本文库构建风险：
1） RNA 总量不足或过低：
可能导致文库构建失败、文库产量低不能上机测序或测序数据量不足；可能导致 RNA-Seq数据 duplication 比例高，随机性差。
2） 降解样品：
可能导致建库失败；可能导致 RNA-Seq 数据 duplication 比例高，随机性差；可能导致 Small RNA 分析来源于 rRNA 数据污染比例高，影响有效数据，文库片段分布异常；可能导致基因定量不准。
3） Small RNA 血清/血浆 RNA：
样品浓度极低，建库风险高，可能导致建库失败；文库中可能接头污染率高，基因组比对率低。
4） Small RNA 含量低：
部分样品总 RNA 达到要求，但是由于样品特异性，small RNA 含量远远低于正常样品（如培养细胞等），可能导致建库失败。
5）Small RNA（<200 nt）样品：样品中降解的 rRNA/tRNA 比例无法预估，文库中可能 rRNA/tRNA污染比例高，严重影响有效数据。
6）蛋白或其他不溶杂质污染：
可能影响 Small RNA 电泳分离，造成切胶不准，影响文库质量（常见于血清样本）；可能影响 RNA-Seq 磁珠分离 mRNA 及反转录效率，导致建库失败；即使达到上机要求，也可能导致 RNA-Seq 文库随机性差，duplication 比例高，基因定量不准（常见于多糖多酚植物样本）等问题。
7）OD260/280≤1.8，OD260/230≤1.8。某类样品 OD 值未达到要求：
可能影响 RNA-Seq 磁珠分离 mRNA 及反转录效率，可能造成基因定量不准。 RNA-Seq文库随机性差，duplication 比例高；甚至建库失败。 OD 值越接近标准值风险越小，反之则风险越大。
8）“去 rRNA 样品”中仍残留有 rRNA：可能导致 rRNA 比例高，有效数据偏少。
9） cDNA、 mRNA 样品：测序质量较难保证。
10） 检测结果 5S rRNA 峰高，会影响有效定量的准确性，造成下游取样不准或影响测序数。
11） 受病毒侵染的样品，测序数据中可能会有较高比例的病毒序列，影响测序数据质量。
样品处理注意事项：
1）送样优先选择新鲜采集的样本；其次才是冻存样本或者经过干燥处理的样本。样本的取材优先选择核酸含量相对较高的组织，如动物，尽量选择肝脏，肺，脾等组织；而植物尽量选取幼嫩的器官。
2）组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证提取质量，应注意在寄送组织样品前进行备份。
3） 液氮冷冻方式是多数组织样品选取的处理方法，详解如下：
a. 组织取样前需准备好冷冻组织的足量液氮，预装样品的 15/50 mL 离心管，管盖须钻孔（防止管子内液氮体积膨胀爆炸），并在离心管内加满液氮；
b. 组织离体后需快速清洗，立即浸入装有液氮的离心管中彻底冷冻（避免将样品先放入离心管，再将离心管放到液氮中）；样品彻底冷冻后，再将样品转至-80℃保存；
c. 无法使用离心管采集保存的样品，离体后仍需将样品立即浸入液氮彻底冷冻，再选用合适的容器包装，包装后需再浸入液氮中彻底冷冻一次，最后将样品转至-80 ℃保存；
4）用于 RNA 样品制备实验的组织样品处理及切割过程应在冰上尽可能快速进行，时间过长会导致样品 RNA 降解。
5）反复冻融和长期保存的组织有更多的降解风险。客户应确保寄送之前组织没有被反复冻融，特别是对于类似动物肝脏，脾脏，肾脏，心脏，脂肪，脑，肿瘤等有较高 RNA 酶/DNA 酶活性的组织。
6）对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有可能请根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。
7）临床操作过程中收集的病理或正常样品如果不能立即处理，应在切开后立即保存于液氮中。
8）对于多糖多酚的植物样本（特别是木本类植物），建议在采集样本之前，将样本置于黑暗环境 24-48 小时后再取材。如果需要立即取材，请尽快采集好样本后，迅速置于低温保存或运输，减少因酚等化合物的氧化对核酸的影响。
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