慢乙肝治愈:从发现到机构批准

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注：由于文章内容过长，翻译多有不正确之处敬请谅解并指出，不胜感激！

几款针对慢乙肝的新型抗病毒和免疫调节疗法的到来，让对这些疗法的疗效和安全性进行标准化评估，以及新的或附加的治疗终点的定义从而预知临床试验变得更为必要。为了把该领域向前推进，，美国肝病研究学会（AASLD）和欧洲肝病研究学会（EASL）于2016年9月8-9日在弗吉尼亚州亚历山大市组织成立了乙肝治疗终点工作组（Hepatitis B Treatment Endpoints Workshop）。,从事乙型肝炎诊断测试和治疗药物开发的生物技术和生物制药公司以及学术界，以便就治疗终点达成一致意见，指导针对乙型肝炎治愈的临床试验设计。

202名参会者中有66名（33％）人员完成了一次会前调查，，行业的31名，学术界28名，其他保健部门3名。在研讨会期间，专家们回顾了慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染的自然病史，目前批准药物的治疗疗效，潜在的抗病毒靶标和使机体恢复对HBV产生免疫应答的方法，以及介绍用于慢乙肝治疗的正处在临床前和早期临床试验阶段的新型抗病毒药物和免疫调节数据。研讨会实施了一次关于HBV治愈定义的会议；有效终点，安全性评估，目标人群和临床试验的设计；以及支持治愈疗法开发所需的诊断测定。这些议题在一项涵盖所有组成团体代表的23位专家（包括4位作者）组成的闭门会议上进行进一步讨论。本报告总结了为期两天的会议讨论情况和一致意见。

慢乙肝治愈的定义

开发新型疗法的目标是实现慢乙肝的治愈，例如，清除乙肝病毒，从而允许实现无病毒反弹和肝病进展风险的停药。然而，面临的一个事实是，由于HBV DNA整合到宿主基因组中，治愈也就变得不那么容易实现；某些即使已经从急性 HBV 感染中康复的人，仍然可以在肝脏中检测到共价闭合环状状DNA(cccDNA)的存在，一旦这些已经“康复”的人的免疫系统受到深度的抑制，乙肝病毒就会再次激活重新复制。然而，急性乙肝感染中临床康复的，慢性乙肝感染自发性清除的，在核苷（酸）类似物或干扰素治疗期间或治疗后的这些人的血清中是无法检测到乙肝表面抗原(HBsAg)的，尽管存在HBV基因组持续整合的可能性，实现HBsAg水平的无法检测的可行性仍然有争议。

会议的一项关键目标是建立慢乙肝治愈的定义。在此次会议上提出了三种定义慢乙肝治愈的定义：1）彻底无菌的治愈（complete sterilizing cure）：血清中无法检测到HBsAg，根除HBV DNA，包括肝内 cccDNA 和整合 HBV DNA；2）功能性治愈（functional cure）：在完成有限治疗过程后，血清中 HBsAg 和 HBV DNA 水平持续处于未能检测水平，伴随或不伴随乙型肝炎表面抗体（抗HBs）的血清转换，解决残留肝损伤，肝细胞肝癌风险降低（还讨论了几个功能性治愈的指标，包括cccDNA转录完全停止，消除cccDNA，完全解决肝损伤，消除HCC风险）；3）部分性治愈（partial cure）:在完成有限治疗过程后,HBsAg处于可检测水平，但 HBV DNA 持续处于未能检测水平。

绝大多数(87.9%)的受调查对象选择了功能性治愈（HBsAg持续消失）作为新的HBV 治疗目标。这一选择得到了其他与会者和专家小组的赞同，认为这是一个可行的目标。此外，功能性治愈提供了几个优势：评估容易，测试广泛可及，它与临床结果的改善和更低的疾病再激活率相关，一旦实现，就不再需要更进一步的治疗。

关于是否要实现anti-HBs血清转换的必要性的共识达成较少，因为是否持续的HBsAg消失和HBsAg消失的临床获益是否是依赖于anti-HBs的出现是未知的。重要的是，对于功能性治愈来说，很少有参与者认为cccDNA的清除是强制性标准。少于一半的参与者认为需要使cccDNA转录失活，这反映了正在开发中的新疗法是否可以沉默或清除cccDNA以及在检测cccDNA时的实际困难存在不确定性。

相对于功能性治愈，一些专家组成员考虑部分性治愈（停药后 HBV 复制处于持续抑制状态，但HBsAg持续存在）是一个可接受的中间性步骤，因为部分性治愈在短期内更容易实现，且已被证明能减少临床结果，并能加快药物开发。

慢性 HBV 感染的自然史

慢性乙肝病毒感染的自然史不一，取决于复杂的宿主免疫应答和病毒之间的相互作用。慢性乙肝病毒感染根据三种临床参数人为分为四个阶段：谷丙转氨酶（ALT）浓度，血清 HBV DNA水平，和乙肝e抗原(HBeAg)状态(Fig. 1)。第一期主要由 HBeAg 出现和高水平的血清 HBV DNA（通常＞200 000 IU/ml）表征，但ALT正常。被称为免疫耐受期，近期有研究对免疫耐受概念提出挑战，在免疫耐受期患者中观察到的HBV特异性T细胞应答与免疫活动期观察到的频率相似，这一发现导致一些人提出，在免疫耐受期（与免疫活动期期间的炎症相反）免疫应答被更好地表征为低炎症。

免疫耐受期之后是HBeAg阳性的免疫活动期，此期的ALT升高。在相应的干预后，HBeAg 血清学转换HBeAb出现，大多数患者转变为非活动的携带期，此期ALT水平转为正常，血清 HBV DNA 水平降低或处于未能检测水平。在某些患者中，血清 HBV DNA 和 ALT 水平会再次升高，在数年或数十年之后。这些患者被认为处于“HBeAg阴性免疫活动期”，主要的表现为 HBV DNA 和 ALT 水平波动。在非活动携带者中HBeAg阴性免疫活动性肝炎平均发生率为0.37%。一些患者并不完全按照这些阶段发展。

血清 HBsAg 在免疫耐受期处于最高水平，而在非活动携带期则处于最低水平。因此，血清学定量HBsAg水平或将帮助确定感染所处的阶段，尤其是HBeAg阴性人员，还能预判疾病的进展和HCC对于HBeAg阴性且低病毒血症 (HBV DNA <2,000 IU/mL)患者。由于慢性乙肝病毒感染的分期是基于临床而不是免疫检测，近日欧洲肝病研究学会提出将这四个阶段描述为Phases 1, 2, 3，4。处于Phases 1, 2期的患者HBeAg或许是阳性的，而Phases 3，4期的患者HBeAg是阴性的，这些有非活动疾病(phases 1 和 3)的将被认为处于慢性感染，而这些有活动性疾病(phases 2 和 4)的将会被认为有慢性肝炎。

一些患者会自发的清除HBsAg，但这种事件是罕见的，每年只有0.5%-1%的概率。这些患者的乙肝核心抗体也叫抗-HBc仍然是阳性的，一些人可能发展出anti-HBs。多数已经清除HBsAg的患者血清HBV DNA处于未能检测水平，但一些人的血清中仍然有 HBV DNA ，而所有患者的肝脏中仍然有 HBV DNA。这些患者被认为已经发生HBV 感染。然而，肝硬化和终末期肝病的风险已经大幅降低，肝癌的风险在HBsAg消失后仍然存在，尤其是HBsAg消失发生在50岁以后或发生在已经发展为肝硬化之后。重要的是，HBV 可能再次激活在免疫受到抑制的情况下，提示彻底将 HBV 从宿主体内清除是罕见实现的。

在管理慢性HBV感染中识别具有发展为肝硬化和肝癌的高风险个体是一项重要目标。近期的研究已经强调病毒载量在预测肝硬化和肝癌中的重要性。然而，许多其他的宿主（性别，年龄，肝癌家族史，肥胖，糖尿病），病毒（HBV基因型和变异合并其他病毒感染：HCV，HDV，HIV）和环境（酒精，吸烟，致癌物）因素均对肝脏疾病进展有贡献。

如今已经建立几个风险模型用来预测肝癌风险。这些模型中的多数采集的数据来自亚洲。这些模型适用于所有种族/民族群体和HBV基因型，有无肝硬化的患者，和未经治疗患者以及这些接受抗病毒治疗还没确认的。肝硬化是肝癌的主要风险因素。在过去几十年，无创性评估——血清标志物管道和肝硬度测量——已经在很大程度上取代了在肝活检上的肝纤维化分期。这些无创性检测还被用于预测慢性HBV感染者的生存和肝癌，因为这些手段在诊断肝硬化上的精确度非常高。

目前的HBV治疗状态

 

治疗目标和有效性评估

 

HBV的治疗目标是预防肝硬化的发展以及肝失代偿、肝癌和HBV相关肝脏疾病的死亡。慢性乙肝病毒的最终临床结果需要几年，甚至几十年的监控；因此，生化学（ALT正常化），病毒学（血清HBV DNA 获得抑制），血清学（HBeAg和/或HBsAg消失伴随或不伴随HBeAb 和anti-HBs 的血清转换），和组织学（肝坏死性炎症减少伴随或不伴随肝纤维化的改善）标记物已被用作临床结果的替代物——肝硬化，肝失代偿，HCC和HBV相关死亡——-并评估治疗，应答和预后指标。停药后应答的持久性是可变的。

 

治疗适应症

治疗的决定是基于对疾病进展的临床评估做出的，跟疾病多出的阶段有关。这些风险评估主要依据 HBV DNA和ALT水平和疾病所处阶段，以及肝脏活检的评估或肝纤维化的无创分期。目前的治疗指南建议对肝硬化和失代偿期肝病患者，对没有肝硬化的患者，但有中度至高度病毒血症和生化学或组织学证据的患者也需要进行治疗。持续高水平的HBV 复制同时合并肝脏炎症增加患肝硬化和HCC可能；然而，目前可用的治疗手段对处于免疫耐受期的患者效用低下，对于此类患者不建议治疗。

已获批准的治疗方案

 

目前已经批准了两类抗病毒治疗方案用于慢乙肝治疗：干扰素和核酸类似物（NAs）。相较于核酸类似物，干扰素的一个优点是较高的HBeAg 和HBsAg 消失率，尤其是基因A型病毒感染者。聚乙二醇干扰素用药48-52周，有24%-27% 的患者发生HBeAg 血清学转换，有3%-7%的患者出现HBsAg 消失，而NA治疗相同疗程发生HBeAg 血清学转换的患者为 12%-22%，HBsAg 消失为0%-3%。对干扰素的应答持续时间更长，停药后也可能会发生HBeAg 和 HBsAg消失，但若停用NA则常会出现病毒反弹，即使 HBV DNA已经处于未能检测水平。然而，相较于 NA，干扰素在抑制病毒复制上稍弱，且需要胃肠外给药，还会出现多种不良反应，对失代偿性肝硬化或肝炎严重恶化和患有自身免疫性疾病或精神疾病患者是禁忌。NA口服给药，具有可忽略的不良反应。建议的一线NAs药物恩替卡韦和替诺福韦耐药风险较低；但对于大多数无固定疗程的治疗需求增加了治疗成本和依从性降低及不良反应风险的增加。

现已经有各种关于干扰素联合NA的评估研究，但多数的研究并没能观察到叠加的效应，相较于单药治疗。近期一项聚乙二醇干扰素联合替诺福韦的研究显示，在用药第72周，HBsAg的消失率增加到 9%，但这项获益主要在基因A型患者中观察到。因此，迫切需要研发能长久抑制HBV复制的新药，从而确保在有限的疗程后能降低肝脏炎症和肝纤维化。此外，还需要更多的研究以鉴别哪些患者可以安全停药。需要重点注意的是，HBsAg消失发生在老年或发展为肝硬化之后并没能消除肝癌发生风险；然而，采取进一步的治疗从而预防肝癌的获益目前还无法证实。在疾病早期能导致功能性治愈的治疗或对预防肝癌有较大的影响。

缺少能够影响cccDNA的NAs

 

HBV“治愈”的一个主要障碍是cccDNA在肝细胞核中以非整合形式或游离体的形式存在。cccDNA作为所有病毒RNA转录的模板，包括前基因组RNA （pgRNA ），因此，其在病毒的生命周期中起关键作用。cccDNA的来源有两种：病毒传入和从肝细胞细胞质壳化DNA的循环利用。cccDNA的半衰期很长，因此这也就解释了为什么HBV感染很难治愈以及为什么在自发性清除或免疫抑制后，HBsAg清除多年后HBV会再次激活。链终止NAs能阻断pgRNA 向 HBV DNA的反转录，但他们对cccDNA的产生，稳定性或转录只有边际效应。来自cccDNA和整合病毒基因组的持续转录或可以解释在NA治疗期间尽管血清HBV DNA水平处于未能检测水平但血清HBsAg水平降低的幅度相对较小。不幸的是，目前针对循环HBsAg的检测手段不能区分HBsAg 的转录是来自cccDNA与集成HBV DNA。

 

抗病毒治疗对临床结局的影响

 

多数，但不是所有的长期随访研究和meta分析显示，干扰素和 NA治疗降低HCC和肝脏相关死亡风险。一项具有里程碑式的随机对照研究显示，在晚期肝纤维化或肝硬化和高病毒血症患者中，一代NA药物拉米夫定降低疾病进展和HCC风险。几项研究已经显示在NA治疗期间保持病毒处于受抑制状态跟肝纤维化的转归，肝硬化的逆转和肝失代偿的发生率降低具有相关性。HCC的风险的确降低，虽不是彻底消除，也是NA治疗期间唯一的主要并发症。出现肝硬化的人经过几年的持续治疗后观察到肝癌发生率降低更加明显。

新型抗病毒疗法

近期大量的科学研究发现已经让我们对乙肝病毒的生命周期有了更多的了解，包括识别出HBV进入细胞的细胞受体，参与cccDNA形成的关键酶核及其表观遗传调控信息，观察到通过IFN或核因子-JB信号传导途径诱导的局部cccDNA降解，和乙肝X蛋白（HBx蛋白）在HBV转录中作用的识别。改善的细胞和动物模型也为在体内外评估新型化合物的抗病毒效用和潜在的毒性提供了条件。大量乙肝病毒领域基础研究取得的进展为识别多重新型治疗靶点铺平了道路(Fig. 2)，“治愈”乙肝开拓取得实质性的进展。

在研新药列表

HBV进入抑制剂

HBV进入肝细胞的途径涉及病毒附着到硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)，从而让HBV pre-S1结合到人类钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)，随后膜融合和核衣壳在感染细胞细胞质中释放。

进入抑制剂可根据它们的作用模式来分类。（1）中和性抗体靶向 HBV S区抗原环或在Pre-S1区的N末端表位。这些抗体具有高度特异性，但需要胃肠外给药，大量的抗体需要中和循环亚病毒包膜颗粒。（2）附着抑制剂是带负电或带正电荷的药物结合到病毒（例如，肝素）或蜂窝硫酸乙酰肝素蛋白多糖（例如，聚-L-赖氨酸）的药物。它们有效但不具特异性。（3）NTCP的底物包括共轭胆汁盐（例如，牛磺胆酸盐，依泽替米贝）和由NTCP输送的其它小分子；在受体的高浓度和短半衰期时间要求限制了其临床应用。（4）不可逆的NTCP抑制剂：myrcludex B（肉豆蔻酰化前S1肽），环孢菌素A，及其衍生物（是NTCP的变构抑制剂）。它们在非饱和浓度下可以不可逆的阻断受体功能，并且在受体中的半衰期长，但它们可以在高浓度下阻止胆汁盐和其他NTCP底物的运输。

进入抑制剂或可阻止未感染肝细胞新生cccDNA的形成，并可能在预防母婴传播或肝移植后的再感染上要比在清除慢性感染人群中的HBV更有效。

myrcludex B联合或不联合聚乙二醇干扰素的临床研究正在慢性乙肝病毒感染和慢性丁型肝炎病毒感染的患者中进行临床试验。

靶向cccDNA损坏和毁灭

 

有一系列研究表明，虽然cccDNA处于肝细胞核的辟护之下但仍有可能靶向cccDNA。在培养的肝细胞研究中显示有几种因子（IFN-α，LTβR，IFN-γ，TNFα）可以调节路径使APOBEC3A/B脱氨酶上调，相应的引起非肝毒性cccDNA的毁坏。然而，在这些培养细胞中仅有部分的cccDNA遭到毁坏。DNA切割酶，包括归巢核酸内切酶或大范围核酸酶（meganucleases），TAL效应器核酸酶，锌指核糖核酸酶和CRISPRassociated（CAS）核酸酶均专门在实验模型中被靶向cccDNA进行探讨。一些研究提示在对感染的细胞进行干扰素用药后，通过CRISPRassociated（CAS）核酸酶进行的HBV DNA编辑清除要比APOBEC介导的胞嘧啶脱氨要更有效。将这些基因编辑器输送至HBV感染的肝细胞而没有意外的脱靶效应在可以在临床上测试之前需要进行处理。

 

功能性沉默

病毒cccDNA组织成染色质样结构受表观遗传调控。表观遗传学修饰可能阻断cccDNA的转录活性和关闭病毒蛋白的表达；但是，如果没有特异性，它们可能会诱发对宿主细胞的有害影响。一些细胞因子，包括IFN-α已在临床前研究模型中被证明通过表观遗传修饰转录能减少cccDNA。HBx已被证明是cccDNA转录和病毒复制所必需的，通过降低Smc5 / 6限制因素；因此，HBx是一个有吸引力的需要沉默的病毒靶标，而不仅仅是cccDNA的转录而且还有其它几个HBx依赖，病毒相关细胞作用机制。目前cccDNA的检测手段缺乏特异性，因此需要开创一套标准的cccDNA检测或cccDNA转录检测方法。

 

靶向病毒转录

 

使用RNAi（RNA干扰）技术抑制HBV复制已经在体外研究中进行广泛评估并在动物模型中验证。小干扰RNA(siRNA)技术可被设计用于靶向任何病毒转录，通过RISC/Ago2相关诱导其下调，进而导致基因沉默。该技术潜在的局限性为静脉注射用药，脱靶结合风险，输送工具的潜在毒性，各种识别受体的免疫激活风险。三种不同输送方式的siRNA药物正处于临床前研究评估和/或早期临床试验阶段。一项初步的phase 2期临床试验结果显示，单剂量的ARC-520在联合恩替卡韦用药后，在HBeAg阳性HBeAg阴性慢乙肝患者中能深度和持久的降低血清 HBV DNA水平，在HBeAg阳性慢乙肝患者中HBsAg水平降低，但HBeAg阴性慢乙肝患者未见HBsAg水平降低。siRNA的设计初衷为靶向cccDNA所有转录本的共同体，对在HBeAg阴性患者中HBsAg水平的影响不大被认为是由于来自整体HBV DNA的病毒转录物序列的改变。需要进一步的研究来确定单独HBsAg水平的下降是否足以恢复HBV特异性T细胞应答，或者是否需要添加其他抗病毒或免疫调节疗法。

靶向病毒转录物的反义寡核苷酸可以通过核糖核酸酶H切割的蛋白质翻译和/或RNA降解空间封闭来阻断病毒蛋白质表达。体外和体内临床前评估显示了其在抑制病毒复制和降低病毒抗原载量上的潜力，但最佳的药物递送仍然是一个挑战。

 

核衣壳组装和pgRNA包装

 

核衣壳形成和pgRNA（病毒复制的模板）的包装是病毒生命周期中关键的步骤。因此，开发针对这一过程的抑制剂或调节剂是一个有吸引力的治疗途径。HBV核心蛋白参与病毒生命周期的许多方面，包括将病毒基因组转运到细胞核，解开以释放细胞核中松弛环状DNA，包装聚合酶蛋白和pgRNA，衣壳装配，逆转录调控和跟病毒组装的包膜蛋白相互作用。它可能具有额外的功能，包括cccDNA染色质的调节和稳定性，病毒RNA的核输出和先天免疫的调节。

HBV前核/核心蛋白最近已经被作为有希望的直接抗病毒靶标。随着对核心蛋白三维结构的认知，现已经开发了几类称为核心蛋白组装调节剂的非核苷小分子，包括苯基丙酰胺和杂芳基二氢嘧啶衍生物。这些分子可以加强蛋白质 - 蛋白质的相互作用，抑制pgRNA的壳化和阻断加链DNA的合成。在研的新药NVR3-778在phase1b期临床中第一次用药后便使血清HBV DNA, HBV RNA,和 HBsAg下降，当跟聚乙二醇干扰素联合应用时作用力更深。

 

靶向HBsAg

 

通过cccDNA转录或病毒mRNA转录抑制病毒基因表达的策略能降低血清HBsAg水平。由于慢乙肝患者中大量的循环HBsAg，旨在中和和/或消除血液中HBsAg的单克隆抗体不可能有效，除非与其他方法联合使用。

 

已经显示核酸聚合物（NAPs）能通过尚未知的机制降低HBsAg的分泌。REP 2055和REP 2139先单用然后与聚乙二醇干扰素或胸腺素α-1联合用药诱导了一些患者的循环HBsAg水平和病毒血症显著下降和在某些患者中出现抗HBs的血清转换。在替诺福韦和聚乙二醇干扰素与REP 2139或REP 2165的联合用药试点研究中观察到类似的结果。这些结果需要在较大的研究中进行重复，且必须解决细胞内残留HBsAg导致的细胞毒性的可能。

 

对HBV的免疫应答和免疫调节疗法的启示

 

精心设计激起的先天和适应性免疫反应是感知和控制HBV感染所必需的。在慢乙肝患者中，通过诱导先天的促炎反应和细胞因子应答是非常微弱的。在急性肝炎患者中发现了自然杀伤细胞产生的IFN-γ，但在慢性肝炎患者中未能观察到。在慢乙肝患者中，HBV特异性T细胞对于HBV控制来说是必须的（它在肝脏炎症中或许还起着一定的作用）同时也是功能失调的，或许是被耗竭或删除。它们表型的疲惫被认为是持续的表面抗原的暴露进而增加了T细胞抑制应答的抑制，这给专注于降低HBsAg的产生提供了理论基础。由于慢性乙型肝炎中B细胞功能障碍的表征不足，因此接受抗集群分化治疗的患者HBV复发率高，这表明B细胞在慢性乙型肝炎的免疫控制中发挥作用。因此，现在提出了通过调节免疫产生或恢复HBV特异性免疫应答的几个潜在靶标，. 3)。现在免疫调节治疗的主要问题是担心诱导不受控制的肝脏炎症和自身免疫反应。

 

干扰素

 

IFN-α已经被用于慢乙肝和慢丁肝的治疗。IFN-α 诱导编码具有抗病毒性质的细胞内或分泌效应蛋白的 IFN-敏感基因的表达。近期的研究显示IFN-α 还能抑制pgRNA包装，增强cccDNA的降解，以及发挥cccDNA转录的表观遗传修饰。有超过70%的患者对IFN-α（HBeAg血清学转换）产生持续应答。对基因A型感染的IFN非反应性和较高反应速率的机制的了解可能会引领新的抗病毒和/或免疫调节疗法的新靶点的发现。

 

病原识别受体

 

病原体识别受体是先天免疫系统感知的重要途径。现已研究了具有toll样受体7,8或9的肝内先天免疫应答的药理活性。GS-9620是一种口服类固醇受体7的口服激动剂，其能导致HBV感染黑猩猩血清HBV DNA和HBsAg水平以及肝HBV DNA的下降。在土拨鼠中也观察到类似的效果，但在人类中也没有观察到。动物模型和人类结果之间的差异突出了在药物开发早期在人体中测试新疗法的重要性。

 

IFN基因激动剂刺激因子

 

IFN基因激动剂刺激因子是多种细胞质DNA受体和识别细菌第二信使的病原体识别受体的接头蛋白，可能是先天免疫反应的药理学活化的潜在靶标。IFN基因激动剂刺激因子可能还可以用作治疗性疫苗接种的佐剂。视黄酸诱导蛋白1不仅显示出诱导IFN和细胞因子的产生，而且通过感知pgRNA的ε结构来抑制HBV的复制。据认为，二核苷酸SB 9000的口服前药SB 9200可激活视黄酸诱导蛋白1和含有核苷酸结合低聚结构域的蛋白质2，能导致病毒感染的细胞中IFN介导的抗病毒免疫应答和血清土拨鼠肝炎病毒 DNA和表面抗原水平的降低。该药目前正在临床试验。

 

检查点调节（CHECKPOINTMODULATION）

 

在慢性HBV中缺乏T细胞介导的应答部分是由于包含程序性细胞死亡，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4淋巴细胞活化基因和粘蛋白结构域受损的T细胞效应子功能的过度表达。免疫抑制细胞因子（包括白细胞介素10）也可能损害T细胞功能。最近的癌症治疗已经表明了用抗体阻断这些抑制性受体的潜力。这种抑制可以逆转乙型肝炎的免疫功能障碍，就如同在土拨鼠研究和人类离体研究中所证实的。这种方法的主要问题是诱导不受控制的肝炎和自身免疫反应，因为这些反应可导致致命的器官损伤。

 

治疗性疫苗

 

治疗性疫苗的目标是刺激或增强宿主免疫应答以恢复免疫控制，实现对HBV复制的持续抑制并最终导致HBsAg的消失。具有或不具有强效佐剂的常规HBsAg疫苗，T细胞疫苗，HBsAg和人类抗HBs的免疫复合物，表达HBV抗原的凋亡细胞，DNA疫苗和表达HBV蛋白的病毒载体的治疗性疫苗策略已被评估具有有限的成功。病毒载量高的患者反应较差，肝硬化患者可能会导致免疫性肝炎产生的高风险。用NAs进行预处理以抑制HBV复制可能会增强HBV特异性T细胞应答并预防炎症发生。GS-4774是一种表达HBV S / C / X融合蛋白的热灭活酵母基疫苗，在健康志愿者中能诱导HBV特异性T细胞应答，但是在NAs病毒抑制的慢性乙型肝炎患者以及那些未经治的患者中未观察到HBsAg降低和HBsAg消失。下面是一系列正在临床试验的治疗性疫苗。

抗病毒和免疫调节治疗的联合

 

靶向HBV生命周期多个阶段进而抑制病毒复制和病毒抗原产生的抗病毒治疗和恢复对HBV免疫应答的免疫调节疗法的联合应用似乎能实现HBV的“治愈”目标，但该采用哪种特异性的药物联合并不知晓，因为多数的抗病毒或免疫调节药物在临床评估阶段，不是在phase 1b 期就是在 phase 2期。已经在自发性自愈或抗病毒（IFN或NA）介导的HBeAg或HBsAg消失的慢性HBV患者中证实了HBV特异性T细胞功能可部分恢复的可能性。随着靶向HBV生命周期中不同步骤的siRNA或抗病毒药物的新方法联合应用的逐步可及，。抗原负荷的减少可能有助于HBV特异性T细胞应答的恢复。在历史上，免疫调节疗法主要集中针对处于免疫活性阶段的患者，但最近的研究表明，在“免疫耐受或高复制非炎症”阶段的患者也应被认为是存在HBV特异性T细胞表达的。在肝病早期阶段“治愈”乙型肝炎的能力理论上对降低肝癌风险有较大的影响。

旨在治愈HBV 的临床试验

 

临床试验的有效终点

 

原先的干扰素和NA类药物试验以生化学，病毒学，血清学和病理学终点来评估有效性，而更近期的试验已经专注于病毒学和血清学终点，因为这些终点已经显示出跟临床结局的改善有相关性。由于缺乏正常ALT的标准化定义，生化终点的使用是有问题的。此外，随着肥胖和非酒精性脂肪肝病的流行率的增加，ALT正常化的失败可能不一定表明HBV引起的肝脏炎症持续。事实上，NAs的phase3期临床试验一直发现，达到生化学终点的患者百分比低于病毒学应答终点。在评估肝脏疾病中肝脏纤维化的无创评估在临床实践中取代了肝活检，评估功能性治愈组织学终点或将不再实用或必须。然而，在概念验证研究中可能需要肝组织活检查来确认新的作用模式和/或验证抗病毒活性的非侵入性替代标记物。

 

对于抗病毒和免疫调节治疗试验，调查受访者分别将血清HBV DNA的抑制到未能检测得到和HBsAg的消失作为phase 2期和phase 3期试验的最重要的首要有效终点，专家组同意。phase 2期和phase 3期试验的首要疗效终点的差异反映出，希望在phase 2期试验中有更早的读数，并且在较短治疗后可能也难以达到HBsAg的消失。在纳入使用NAs治疗获得病毒学抑制病人的试验中，HBV DNA的抑制不是一个适当的终点。在某些试验中已经将HBsAg的下降作为终点，但是HBsAg水平下降的动力学是否可以预测HBsAg的最终消失是没有达成共识的。

对评估新型抗病毒或免疫调节疗法的phase 3期试验的首要疗效终点的最合适时间应为治疗后第6个月这一概念达成一般性共识（约65％）。这一选择反映了在有限的治疗过程之后实现持久应答（“治愈”）的意图。在phase 2期试验中评估有效性的最佳时间点方面的共识较少，分为治疗6个月后与治疗后6个月两种观点。专家小组指出，评估疗效终点的最合适时间可能取决于药物的作用机制和半衰期。例如，抑制HBV pgRNA逆转录HBV DNA的药物预计会导致血清HBV DNA水平的快速下降，而旨在恢复免疫应答的药物可能需要更长时间才能对病毒载量产生任何可测量的影响。专家组还强调需要长期随访以确认应答的耐久性和对临床结局的影响。

决定治疗有效性的新标志物诊断方法

 

对于需要标准化测定方法来对新型抗病毒或免疫调节剂的作用机理进行了解以及有新的替代标记来评估HBV“治愈”这一理念有共识。(Table 1).

 

血清 HBsAg 方法

 

HBsAg消失被列为新型抗病毒和免疫调节疗法的phase 3期试验的最重要的疗效终点。有些专家建议需要更敏感的 HBsAg 方法。另外专家则指出，血清中HBsAg水平的持续存在可能不是来自持续的cccDNA转录，而是来自整合的HBV DNA基因组。现在需要一种可以区分源自整合HBV DNA的HBsAg还是源自ccc DNA的检测方法。在血清中不能检测到HBsAg并不代表着就关闭了HBsAg的产生，因为循环的HBsAg可能与抗HBs以复合物的形式存在。乙型肝炎病毒产生空白包膜颗粒，其病毒粒子数可能超过1,000倍。可以区分病毒体中的表面蛋白与亚病毒颗粒（大，中，小HBsAg蛋白）的方法将是有益的。

 

血清HBsAg的下降可能被用来作为早期诊断试验的疗效，尽管其预测HBsAg消失的准确性尚未确定。定量HBsAg测定也可用于疾病阶段分类和预后。过去十年来，欧洲和亚洲已经有几种标准化的定量HBsAg检测方法可以使用，而且已就它们将成为新药开发的重要工具达成共识。

 

cccDNA定量和转录活性

 

许多正在开发中新型抗病毒药物旨在增强cccDNA的清除或降解或表观遗传修饰cccDNA转录。可靠地检测cccDNA浓度和/或其转录活性的测定方法将有助于直接评估这些新药的疗效，并且在概念验证研究中是非常宝贵的。目前还没有标准化肝内cccDNA检测方法。然而，有一个共识是，需要适当的肝组织样本，并且需要确保特异性的适当检测措施，特别是存在丰富松弛环状DNA的情况下。

 

临床试验中非常期望能有作为替代肝内cccDNA可靠的血清标志物的测定。几项研究表明，血清HBsAg水平与肝脏cccDNA的相关性要比血清HBV DNA水平更好，这表明它是cccDNA的间接标记物。然而，这种相关性在HBeAg阳性患者中是满意的，而在HBeAg阴性患者中则相对次优。HBsAg可从转录自cccDNA或整合HBV DNA的亚病毒RNA翻译。有人提出，HBsAg主要来源于HBeAg阳性患者的cccDNA，而HBeAg阴性人群中增加的部分主要衍生自整合HBV DNA。近期的研究提示血清 HBV RNA和HBcrAg水平可能比HBsAg水平更可靠地代替肝脏cccDNA。

 

血清 HBV RNA方法

 

绝大多数循环的HBV病毒颗粒含有部分双链的松弛环状DNA；然而，现已报道了含有HBV RNA的循环“病毒颗粒”。这些包含RNA的“病毒颗粒”在接受NA治疗的患者中更丰富，可能是由于NA抑制pgRNA的逆转录导致衣壳pgRNA的积累，其中一些可能被包围和分泌。因此，在接受NA治疗的患者中，在血清HBV DNA已经检测不到的情况下检测血清中的HBV RNA可以推测正在进行的cccDNA转录，并且其已被证明是停止NA治疗后病毒复发的预测因子。血清HBV RNA水平的测定，特别是如果它们对pgRNA具有特异性，可能为转录活性cccDNA提供有用的替代物。

 

血清HBcrAg方法

 

HBV前核/核心基因被翻译成核心蛋白，前核/核心前体和HBeAg；这些蛋白均可以统一测定。HBcrAg可以组装成不含HBV RNA或HBV DNA的有缺陷的包膜颗粒。现已已经开发出了测定所有这些形式的前核/核心基因表达的核心相关抗原免疫测定方法。已经显示血清HBcrAg水平与肝HBV DNA相关，并用于预测中止NA治疗后的病毒复发。血清HBcrAg水平的检测可能为转录活性cccDNA提供间接证据。

 

测定HBV免疫应答的方法

 

对HBV免疫应答的恢复是HBV“治愈”的关键一步。很多免疫调节疗法已经专注于恢复T细胞应答。然而对抗病毒治疗的应答标志物也可以用于评估免疫调节治疗应答，用于测量特异性免疫应答改善以预测病毒清除的标准化测定方法将在早期药物开发中提供信息。需要对用于评估对HBV免疫应答恢复的标准化测定方法达成共识；这种测定方法的方法学，敏感性和特异性；它们在不同实验室的正确解释和重复性；以及测定方法的交叉验证。

 

已经批准的HBV诊断方法

 

在新型抗病毒药物和免疫调节疗法开发的同时开发替代HBV治愈终点的标准检测方法是需要加快研究的。在闭门会议环节，美国FDA和EMA代表提出考虑在所有phase 2 和 3期试验阶段中同时测试多个中间次要终点。研究的测定方法必须标准化，共享数据和测定平台，以便于鉴定适当的替代标记物的有效性。重要的是，新治疗手段的批准与用于测定功效或预测应答的新诊断测定方法的开发和批准相关。

 

安全性和停药规则评估

 

目前NAs的显著安全性对针对疾病所有阶段的新型HBV疗法的安全性提出了严格的要求。在开发乙肝新型疗法过程中唯一担心的问题是严重肝炎的发生风险，因为严重肝炎的发生会导致肝失代偿和死亡。美国FDA对药物性肝损伤的管理提出了明确的建议；然而，这些建议不适用于患有潜在肝脏疾病的患者。此外，暂时性肝炎发作并不总是有害的，并且可能意味着感染肝细胞的免疫清除。肝脏炎症有可能取决于直接药物诱导的肝损伤，药物诱导的免疫介导肝炎（如，检查点抑制剂），潜在疾病（不完全病毒抑制）或感染肝细胞的免疫清除（成功的病毒抑制和伴随的宿主免疫应答恢复）。炎症的时机和过程以及血清HBV DNA水平的相关时机变化可以帮助区分大多但不是全部的肝炎发生的原因：例如，跟药物诱导肝损伤相关的炎症可能是比较特殊的并有可能在任何时间发生。关于肝脏炎症的定义没有共识（与基线相比，ALT增加幅度，绝对值或折叠变化）；然而，大多数调查对象和专家小组同意，伴有胆红素或凝血酶原时间增加的炎症和肝硬化患者的炎症应被认为是严重的。还可能发生其他不良事件，例如siRNA或表观遗传修饰的脱靶作用，与检查点抑制剂相关的自身免疫反应，以及留下的功能障碍病毒颗粒的肝毒性问题。由于安全考虑，就应该何时停止一项试验或新药方案这一问题没有达成共识；然而，调查对象和专家小组指出，只要死亡或肝移植，肝功能失代偿，不可逆转的自身免疫炎症或严重肝炎的发生率超过5%则都应停止。三分之二的调查对象和大多数专家小组建议，安全性和有效性评估应在停止治疗后至少6个月进行。

 

HBV 治愈临床试验的设计

 

抗病毒和免疫调节疗法的联合应用增加HBV治愈的可能性最有机会。在进行联合治疗临床试验之前，应首先建立单一疗法和不常或不重要药物相互作用的单个新药物的抗病毒活性和安全性数据，这点现已达成共识。然而，不需要显示单药治疗的功效。

 

具有HBV相关死亡（肝硬化）高风险的患者和当前治疗效果较差（免疫耐受型，丙型肝炎病毒感染）的患者此刻最需要新的治疗方法。然而，在设计早期临床试验中，目标患者人群必然是那些最有可能有应答并能够耐受肝炎可能加重的人群。协商后一致的意见是：优先在未经治人群中，HBeAg阳性伴随活动性疾病的患者或在NAs病毒抑制的HBeAg阳性或HBeAg阴性患者中进行试验。首先在没有肝硬化的患者中进行概念验证和安全数据建立。

 

设计phase 2期研究的一个特别挑战是确定具有足够异质性的目标群体，他们即代表具有慢性乙型肝炎的群体，但又不具有多样性，因为多个亚群阻碍了分析。调查对象中有59％认为应分别对患者亚群进行研究。如果在同一试验中纳入多个患者群体，患者可能会根据肝硬化，HBeAg状态，HBsAg水平，HBV DNA水平，治疗史和HBV基因型等分层为各个不同群体。需要通过无创性血清标记物和/或肝弹性成像确定肝硬化的标准化标准。

 

鉴于慢性乙型肝炎自然过程的异质性，有一致认为需要随机对照试验来建立疗效，与安慰剂的比较是可行的，

 

鉴于慢性乙型肝炎的自然过程的异质性，在免疫耐受或非活动性阶段患者的试验中，随机对照试验需要建立跟安慰剂进行比较的有效性，这是可行的和道德的，因为目前的指导原则并不推荐给这些病人进行治疗。对于活动性疾病或肝硬化患者，可以将研究性新药与NA或IFN进行比较。或者，可以将新药跟安慰剂进行比较，作为NA外的额外疗法。但就这些试验应旨在表明研究疗法的优越性这点是达成共识的。

总结和建议

 

Table 2中列出了关于HBV治愈临床试验终点和设计的建议摘要。增进对HBV生命周期和对HBV宿主免疫应答的了解有助于发现和设计直接针对多个HBV复制周期的抗病毒疗法，及恢复对HBV感染免疫应答的潜在免疫调节疗法。通过改进细胞和动物感染模型的可用性，将进一步帮助开发新型HBV疗法。虽然这一进展已经提高了治愈乙型肝炎的可能性，但是由于存在整合HBV DNA，要想实现完全清除病毒的治愈，即从宿主中将病毒彻底根除可能是不切实际的。虽然HBsAg清除不常见，但在用NA和IFN治疗期间确实发生了，并且与临床结局改善有关。因此，在使用新型抗病毒和免疫调节治疗进行有限的治疗后，实现功能性治愈（特征是：HBsAg的持续消失伴随或不伴随抗HBs血清转换）的患者比例比现有疗法达到的要高，这是一个可达到的目标。

 

需要促进学术界，，从而建立规范和验证治愈替代标志物，以便促进治愈性疗法的发展，。在进行联合治疗之前，应进行有限的概念验证单药治疗研究以评估安全性和抗病毒活性。鉴于目前已批准NAs药物的优良安全性，任何新的治愈性疗法的安全性将是至关重要的。利益相关者之间的持续合作将使慢性HBV患者获得HBV“治愈”变得可实现。

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