【冯仁丰】糖化血红蛋白标准化和检测准确度现状(下)

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（续上篇）

六、检测HbA1c准确度的现状

1968年，RANBAR等[1-2]首次发现糖尿病患者HbA1c升高。40余年以后，HbA1c已成为糖尿病常规管理和诊断的一个不可或缺的指标。自从里程碑式的临床试验（如DCCT、UKPDS）开展以来，HbA1c标准化检测已经获得了相当大的进展，明确了糖尿病患者血糖控制（由HbA1c检测确定）和并发症的关系[17]。

由于HbA1c检测方法的发展，各大厂商在其产品特点和检测准确度宣传上有很多针对Hb变异体对HbA1c检测结果影响的介绍。尤其是在我国，在厂商刻意夸大宣传的情况下，使临床实验室对其产品优点和缺点的了解很模糊。其实，任何一个检测方法都有其特点和优点，当然也一定有不足之处。

什么是血红蛋白病？

血红蛋白病（hemoglobinopathy）是由于血红蛋白分子结构异常（异常血红蛋白病）或珠蛋白肽链合成速率异常（珠蛋白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血）所引起的一组遗传性血液病。

1. 血红蛋白　血红蛋白是一种结合蛋白，相对分子质量为64 000，由珠蛋白和血红素构成。血红素由原卟啉与亚铁原子组成。每1个珠蛋白分子有2对肽链。1对是α链，由141个氨基酸残基构成，在氧运输中具重要的生理作用。另1对是非α链，有β、γ、δ、ξ（结构与α链相似）及ε 5种。每1条肽链和1个血红素连接，构成一个血红蛋白单体。人类血红蛋白是由2对（4条）血红蛋白单体聚合而成的四聚体。不同类型的血红蛋白其珠蛋白结构略有不同，但血红素均相同。

2. 正常人出生后的3种血红蛋白　正常人出生后有3种血红蛋白：

• HbA，由1对α链和1对β链组成，即α2β2，为正常人主要的血红蛋白，占血红蛋白总量的95％以上；在胚胎2个月时HbA即有少量出现，出生时HbA占血红蛋白总量的10％～40％，出生6个月后即达成人水平；

• HbA2，由1对α链和1对δ链组成，即α2δ2，自出生6～12个月起产生，占血红蛋白总量的2%～3％；

• HbF，由1对α链和1对γ链组成，即α2γ2，出生时占体内血红蛋白总量的70％～90％，以后逐渐减少，至出生后6个月，其浓度降至血红蛋白总量的1％左右。

3. 血红蛋白的基因　血红蛋白不同的肽链是由不同的遗传基因控制的。珠蛋白基因突变使肽链的单个或多个氨基酸替代或缺如，导致珠蛋白分子结构改变，称为异常血红蛋白（或血红蛋白变异体）。全世界范围内经结构分析证实的异常血红蛋白日益增多，至90年代初期已达600多种，但仅不到1/3的异常血红蛋白伴有临床症状。

世界卫生组织估计，全球约有1.5亿人携带血红蛋白病基因，并已将血红蛋白病列为严重危害人类健康的6种常见病之一。异常血红蛋白病在我国以云南、贵州、广西、新疆等地发病率较高，现已发现异常血红蛋白67种，包括α链（34种）、β链（26种）、γ链（4种）等异常，其中19种为我国首见。海洋性贫血多发于华南及西南地区。根据近10年来我国28个省市、自治区近100万人口的普查资料，异常血红蛋白病的发病率为0.33％，α海洋性贫血的发病率为2.64％，β海洋性贫血的发病率为0.66%。

4.异常血红蛋白对HbA1c检测的影响　血红蛋白中大多为HbA（约占98%），因此检测的HbA1c自然也在HbA中，而其他血红蛋白中没有被糖化β链。如果糖尿病患者合并血红蛋白病，其产生的各种异常血红蛋白也会被糖化，或其异常的蛋白结构等会对HbA1c的检测造成一定的影响。

NGSP标准化和IFCC标准化

如前所述，ADA为了得到糖尿病控制是否可以减少糖尿病并发症的结果，针对当时缺乏HbA1c参考物质和参考方法的情况下，采取了标准化措施，得到了全世界第1个结论，即对糖尿病的控制可以减少或减缓糖尿病并发症的发生。美国为了将研究成果在美国国内和全世界范围内应用，实施了NGSP。

正是由于NGSP的实施，今天全球的HbA1c检测结果才均以百分值（%）表示，这也展示了美国NGSP的重大影响。但是，只采用了HPLC层析技术确定HbA1c的NGSP结果已被证实分离的HbA1c不是单一蛋白。而IFCC既有参考物质，又有参考方法，确实在HbA1c标准化上非常完整。因此，ADA承认IFCC为全球的唯一参考系统，并且承认美国的NGSP结果应上溯至IFCC的参考物质和参考方法。这在以往任何领域都从未有过。

但不可否认的是美国NGSP对全世界HbA1c的检测影响很大，而且专注于HPLC离子交换技术的公司，多年来也在HPLC技术上有了很大的改进。IFCC的HbA1c标准化尽管晚了几年，但IFCC对HbA1c标准化的贡献是前人在这个领域从未有过的。为了使IFCC的成果尽快在临床上得到应用，各厂商已经开发出了免疫学方法和酶法用于临床实验室或内分泌实验室检测糖尿病患者的HbA1c，这些方法可以直接报告IFCC结果。

由于IFCC开展参考方法和参考物质的研究并形成相应的检测方法几乎是同一个厂商，所以其在推广免疫学方法的产品宣传上，强调免疫学方法的结果可直接溯源至IFCC参考系统，而且可以不受任何异常血红蛋白的影响；同时指出HPLC无法避免异常血红蛋白的干扰。

在国内市场上，报告NGSP结果的产品生产厂商和报告IFCC结果的产品生产厂商竞争非常激烈。尤其是针对检测方法是否可以特异地消除异常血红蛋白干扰是今天各大厂商竞争的重点。尽管国际上承认NGSP和IFCC结果都有效，但这已经影响了临床实验室对HbA1c结果的解释。

HbA1c各常规检测方法的分析

1.以往HbA1c检测出现差异的原因之一，在IFCC对HbA1c的被测量进行定义前，任何血红蛋白被糖化的形式，都是“糖化血红蛋白”的1个组分，导致“糖化血红蛋白”在定量检测上非常混乱。

以正常的血红蛋白为例，由于在血红蛋白上有多个游离氨基，这些游离氨基均可以被葡萄糖糖化形成糖化血红蛋白，而且在糖化过程中，游离氨基是被随机糖化的，可以在血红蛋白β链N端的第1个氨基酸缬氨酸（β-N-Val-1），也可以在β链的第17、20和66个赖氨酸（β-Lys-17、β-Lys-20、β-Lys-66）的ε氨基，又或在α链-N端的第1个氨基酸（缬氨酸）（1α-N-Val-1）、α链的第7、16个赖氨酸的ε氨基。

在上述7个可以被葡萄糖糖化的位点上，被糖化的任意一个位点、各个糖化位点的任意组合等都是导致各种检测方法出现差异的原因。另外，异常血红蛋白上还有其他可糖化的位点出现。

2.IFCC的HbA1c定义　

为了使糖化血红蛋白检测标准化，IFCC对“糖化血红蛋白”进行定义：β链N端的缬氨酸（Val）被糖化的血红蛋白称为糖化血红蛋白（即HbA1c）。β链上被糖化的其他位点以及α链上被糖化的位点均不予认可为糖化血红蛋白。IFCC在充分考虑了“糖化血红蛋白”分子结构复杂性的基础上第1次明确了HbA1c的定义。只有硬性规定了某个分子结构被命名为“HbA1c”，才能使HbA1c的检测结果在全球具有可比性。但是，不可否认的是没有被IFCC定义规定的糖化血红蛋白是真实存在的。HbA1c在检测量值上实现了全球的可比性，却为临床遗漏了已经发病的糖尿病患者血液中其他分子结构的糖化血红蛋白！

3.HbA1c的常规检测方法（免疫学方法和酶法）  

由于常规检测方法的限制，IFCC参考方法对未糖化的血红蛋白定义为N端缬氨酸未被糖化的β链血红蛋白。但在常规检测中，一般方法难以分离出这个未被糖化的β链血红蛋白。因此，临床实验室还是沿用了传统的检测血红蛋白的方法，以比色法检测样品中的血红蛋白，以“红色”程度来表示血红蛋白总量。可惜，这个方法检测出的是样品中所有含有高价铁离子的血红蛋白，除包括了正常的α、β、γ、δ、ξ及ε链之外，还有各种异常血红蛋白中的各种链。

这与IFCC对HbA1c定义中非糖化部分的血红蛋白仅仅是β链血红蛋白的要求完全不同。所以，最后报告的HbA1c结果的分母部分无形中被放大了。如果免疫学方法使用的抗体完全符合IFCC对HbA1c的定义，那么最后得到的结果就要偏低了。因此，在开始研究HbA1c免疫学检测方法时，Rhea等[19]认为检测方法受干扰了。

Rhea等[19]介绍了使用识别HbA的β链N端糖化氨基酸结构的免疫学检测方法定量检测HbA1c。他们说：“第1代免疫学检测试剂内含的抗体针对的抗原决定簇主要分布在血红蛋白β链的第4～10个氨基酸，包含了第6个可被改变并形成异常血红蛋白[血红蛋白S（HbS）和血红蛋白C（HbC）]的氨基酸位置。正是在这些异常血红蛋白的存在下，HbA1c检测受到了干扰。

这也促使了第2代免疫学检测试剂的发展。第2代试剂使用的抗体包含了血红蛋白β链的第1～4个氨基酸，因此极大地消除了来自HbS和HbC的干扰，与第1代检测试剂相比，其准确度明显被改善了。第2代免疫学检测试剂的抗体通过结合类似于HbA的HbS和HbC，这样为具有杂合子的患者提供了临床上有用的HbA1c检测值，而他们的RBC寿命基本上是正常的”。这篇文章的解释让人迷惑。明明使用了与IFCC参考方法中检测β链N端的六肽对应的抗体，检测的是第4～10个氨基酸的多肽链，应该与IFCC参考方法一致，怎么会出现“干扰”？

经过深入学习后，我理解了：IFCC参考方法只检测β链N端起的六肽，原因是充分考虑到异常血红蛋白在蛋白结构上的突变多发生于HbA β链N端起的第6个氨基酸。正常的HbA β链N端的6个氨基酸序列为Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-；HbS β链N端的6个氨基酸序列为Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-；HbC β链N端的6个氨基酸序列为Val-His-Leu-Thr-Pro-Lys-Glu-。互相比较可发现，HbA、HbS和HbC的第6个氨基酸不同。

因此，IFCC专家非常注重此点，只切下了6个氨基酸多肽进行分析，消除了HbS和HbC对检测的干扰。经典的免疫学方法也遵循了这个特点，避免了HbS和HbC干扰。这应该是非常好的。可是，HbA1c计算公式中的分母部分采用了传统检测方法得到的血红蛋白值。由于传统检测方法检测了所有类型的血红蛋白，违反了IFCC对HbA1c的定义，因此分母部分的数字被放大，导致最后计算得到的HbA1c值缩小了！所以这个结果被说成是受到了“干扰”！

而第2代免疫学检测试剂使用的抗体只针对β链N端第1～4个氨基酸的四肽。这样就回避了第6个氨基酸是否为谷氨酸的特异性要求。所以无论是哪种血红蛋白，只要具有类似HbA的β链N端的4个氨基酸，都能被检测出来！这样就放大了HbA1c计算公式中的分子部分。巧合的是，分母部分因检测了所有各种非糖化血红蛋白而放大，分子部分也因检测了各种类似的糖化血红蛋白而放大！二者放大后的数值相除，得到了与IFCC参考方法检测结果非常相似的数值！

这样的巧合在某公司资料上非常明确，其HbA1c计算公式为HbA1c＝（HbA1c＋HbX1c）/（总血红蛋白＋HbX）。式中的分母是“总血红蛋白＋HbX”，“HbX”为异常血红蛋白；分子是“HbA1c＋HbX1c”，HbX1c是所有异常血红蛋白被糖化的部分。因此，HbA1c的免疫学检测方法在检测量值上可以溯源至IFCC的参考系统。

HbA1c酶法基本原理是首先由蛋白酶从血红蛋白β链N端处切下2个氨基酸的双肽，然后在几个酶的作用下水解，最后显色检测。酶法比免疫学方法更“简练”，只用2个氨基酸的小肽。酶法更加不顾各种异常血红蛋白的结构，只要在β链N端的最后1个氨基酸为缬氨酸的任何异常血红蛋白均列为为检测对象。

让HbA1c检测回到临床实验室的现实世界

从RANBAR等[1-2]在电泳图谱上发现糖尿病患者有异常的血红蛋白起，无论是DCCT还是IFCC，均是利用分离图谱对HbA1c进行定量的。DCCT的实验室在层析分离的图谱上观察到HbA1c峰，并结合未糖化的血红蛋白峰（同时加上HbA1c峰）计算出HbA1c的百分值。IFCC的HbA1c工作组形成的参考方法采用分析型的HPLC技术分离HbA1c和HbA0六肽，然后再进行MS和CE定量！

因此，如今的临床实验室在检测糖尿病患者HbA1c时如果仅仅使用免疫学方法或酶法在自动化仪器上进行检测，其速度更快、成本更低，但结果只有一个检测值，无法了解这个值的背后究竟有无异常血红蛋白。BRY等[20]借用 SACKS等[18]的文章，宣传说：“看看这些HPLC的分离图谱，你就可以知道HPLC分离方法的落后！HPLC根本无法消除所有异常血红蛋白对HbA1c检测的影响，因为很多异常血红蛋白的分离峰掩盖了HbA1c的峰。”其实，我们的检验界同道并没有认真阅读Sacks的这篇文章[18]！如果好好阅读了，才会有真正的体悟。

Sacks博士是世界闻名的糖尿病专家，是他们完成了DCCT这个著名的临床试验，得出了控制血液糖化血红蛋白与糖尿病并发症之间的相关关系。他们正是使用离子交换HPLC方法，采取强制标准化措施，得到了这个伟大的结论。NGSP参考实验室至今依然在使用离子交换HPLC方法检测HbA1c。

尽管将离子交换HPLC方法列为NGSP的参考方法，但是这些顶级专家早在21世纪初就已经以综述的形式告诫所有实验室，必须谨慎使用离子交换HPLC！千万不要将HPLC自动报告的结果发给临床，因为极有可能因患者的异常血红蛋白掩盖了HbA1c而导致检测结果出现错误。必须先看HPLC的层析图，然后再考虑如何发出检测报告。今天，面对免疫学检测方法的强大优势，他们很快接受了不受异常血红蛋白影响的Tina-quant®HbA1c检测系统。尤其是在近2年的文章中，为了解异常血红蛋白对各种检测方法的影响，均将Tina-quant®HbA1c检测系统和硼酸亲和方法列为比较方法，这也充分说明ADA的明确观点。

很多临床实验室依然采用离子交换HPLC作为检测HbA1c的首选。为什么？因为HPLC为每个患者样品提供了一张便于判断和使用的层析图。尽管免疫学检测方法在多个评价中被认为很少受到异常血红蛋白的干扰，然而每一种方法学各有利弊，选择方法学时应取决于不同实验室的实际需求。

上海复旦大学医学院附属中山医院检验科的做法非常值得大家学习。无论是对一致性计划的调查品定值，还是对患者样品常规检测HbA1c，他们均先使用离子交换HPLC。理由很简单，可以看到层析图并作出判断。一旦层析图显示HbA1c难以区分时，他们再采用免疫学方法检测样品，同时结合相同样品的糖化白蛋白和近期患者的血糖表现对患者的血糖状况和HbA1c结果作出判断。

Tina-quant®HbA1c产品说明书写得非常好，其中说到：作为原则，必须小心注意具有异常血红蛋白患者的任何HbA1c结果的解释。异常血红蛋白会影响红细胞的寿命或体内糖化率。在这些情况下，即使分析上正确的结果也不能反映正常血红蛋白患者预期的血糖控制。在疑似存在某个Hb变异体（如，HbSS、HbCC、或HbSC）影响了HbA1c值和血糖控制间关系时，必须不可使用HbA1c进行糖尿病的诊断。

因此，尽管大家都认为免疫学方法很少受到异常血红蛋白的干扰。但ADA的导则明确指出：只要具有异常血红蛋白的患者样品结果，不可任意报告给临床作为糖尿病的诊断依据。

上海复旦大学医学院附属中山医院的做法值得推广。首先使用离子交换HPLC，发现问题后再以免疫学方法进行比较。这个做法完全符合ADA导则的精神。

随着经济的发展，在全国各地人员在国内充分流动的情况下，原先在我国南方地区的人群去全国各地的也越来越多。现在的生活条件好了，出现了越来越多的新糖尿病患者。因此，各地临床实验室千万不可马虎，随时警惕异常血红蛋白对HbA1c检测结果的影响。越到南方，异常血红蛋白的影响越严重。

无论临床实验室采用什么方法检测HbA1c，均应认真了解异常血红蛋白对HbA1c检测结果的影响。尤其是在选择HbA1c检测产品时，一定要详细了解其具体资料，阅读厂商提供的说明书。使用免疫学方法或酶法检测HbA1c的临床实验室最好另外还有诸如离子交换HPLC的产品，它将在确定有无异常血红蛋白时发挥作用。对于正在使用离子交换HPLC的临床实验室，应有诸如免疫学方法或酶法的产品备用。一旦在层析图上出现并确定为异常血红蛋白时，应使用其他方法进行比较，并及时与临床联系，检查患者的糖化白蛋白、近期使用血糖仪自我监测的资料和临床表现等，防止发出错误报告。

针对我国的情况，一些很多经济欠发达的地区特别要注意营养不良、近期有出血史或输血史等。因为这些情况均会影响红细胞的寿命。对于这样的患者不应使用HbA1c作为糖尿病诊断或监测的指标。应该采用糖化白蛋白、果糖胺以及直接葡萄糖检测等项目替代，方能避免错误诊断和延误治疗[17]。

七、总结

HbA1c是诊断和监测糖尿病治疗效果的重要指标。我们要感谢IFCC的努力，使全球HbA1c的检测结果正逐渐趋向一致。

所有可以提供HbA1c检测产品的厂商都不会客观描述自己产品的弱点，只强调他们产品的优点和价值，说些让人感觉更舒服的介绍。当心上当。

为了患者的利益，每个实验室必须完善检测质量管理。在将产品用于临床检测前必须验证产品的分析性能。只有确认产品的分析性能确实如厂商介绍的那样可以信任，方可使用！可惜我国的临床实验室至今都做得很差！期望各实验室引起重视！

一个实验室内必须具备2种检测方法的产品，可以方便地识别患者样品内有无异常血红蛋白。至今，尽管认为免疫学方法无异常血红蛋白的干扰，但国际上尚未从临床上对各种异常血红蛋白对检测结果的影响做出客观的决定。所以，为了患者的利益，临床实验室一定要充分了解更多的信息，大家还需要认真学习！

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