盐酸帕罗西汀肠溶缓释片的研制及体内外评价
Preparation and in vitro-in vivo Evaluation of Paroxetine Hydrochloride Enteric-coated Sustained-release Tablets
曹 焱1,2，张国松1，严轶东2，陈 勇3，李东勲1*
(1. 江西中医药大学，江西南昌 330004；2. 北京阜康仁生物制药科技有限公司，北京 102628；
3. 南通大学药学院，江苏南通 226001)
摘要：采用PVP K30 的水溶液为黏合剂，应用流化床一步制粒技术，分别制备含药层颗粒与基座层颗粒，再压制双层缓释片，最后对素片进行肠溶包衣得盐酸帕罗西汀肠溶缓释片。以参比制剂(Paxil CR) 为对照，分别考察在pH 1.0 盐酸、pH 7.5 Tris 盐缓冲液、pH 6.0 磷酸盐缓冲液和水中的释放行为，以相似因子( f2) 评判二者体外释放行为的相似性。在4种介质中二者释放行为均相似的前提下( f2>50)，建立了Beagle 犬体内分析方法，进一步探究自制肠溶缓释片与参比制剂的体内药动学特征，经过双周期交叉口服给予Beagle 犬盐酸帕罗西汀肠溶缓释片后，自制品的部分药代参数如下：tmax(5.38±3.25)h，cmax(5.57±3.81)ng/ml，t1/2(3.59±2.31)h，AUC0→t(38.34±30.07)ng·ml-1·h，MRT0→∞(7.51±2.97)h；参比制
剂的参数如下：tmax(6.75±7.15)h，cmax(5.84±6.74)ng/ml，t1/2(3.94±2.67)h，AUC0→t(35.48±39.45)ng·ml-1·h，MRT0→∞(7.65±
3.64)h，自制品的cmax 值为参比制剂相应参数的121.90％；二者主要药代动力学参数tmax、cmax、AUC0→t 经对数转换后无统计学差异(P>0.05)，自制肠溶缓释片的相对生物利用度为125.13％ ( 几何均值)。
关键词：盐酸帕罗西汀；肠溶缓释片；体外释放；相似评价；药动学
盐酸帕罗西汀(paroxetine hydrochloride，1) 是口服精神类药物，是一种强效选择性的5- 羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI)，临床上广泛用于各类型抑郁疾病，如强迫症、广泛性焦虑症、社交恐惧症[1—5]。据报道，1在治疗儿童与老年抑郁症患者时亦能表现良好的作用效果和耐受性，预计到2020 年全球市场销售总额能达到140 亿美元[6]。原研厂商目前在国内外上市的剂型有普通片、肠溶缓释片，由于1 口服对胃黏膜有一定的刺激作用，易引起患者恶心等不良反应，而1 肠溶缓释片是在缓释片的基础上包一层肠溶包衣，使药物避免在胃中释放而在小肠中缓慢释放，血药浓度波动小，较普通制剂作用更持久、更安全，对于患者来说顺应性更好[7]，可是双层肠溶缓释片对制剂技术要求较高，国内仅有1 的普通片仿制品上市。
为此，本试验采用聚维酮(PVP)K30 水溶液为黏合剂，应用流化床一步制粒技术，分别制备含药层颗粒与基座层颗粒，再压制双层缓释片，最后对素片进行肠溶包衣得1 肠溶缓释片。依据国家食品药品监督管理局2010 年8 月颁布的相关进口药品注册标准( 标准号GBT JX200090263，1 肠溶缓释片) 释放度项下标准[ 8]，参考中国药典2015 年版四部通则0931 方法二，制定1 肠溶缓释片释放试验方法，评价自制品与参比制剂(Paxil CR) 体外释放曲线的相似性。
在Beagle 犬体内药动学研究中，以甲苯磺丁脲(tolbutamide，2) 作内标建立了UPLC-MS/MS 法测定血浆中1 的浓度，并对其分析方法进行验证，为将来1 自制品的临床研究提供质量保障，也为1 肠溶缓释片后续药学研究提供参考。
1 仪器与试药
2 方法与结果
2.1 体外药物释放试验
2.1.1 1 的含量测定方法
2.1.2 体外释放度的测定
pH 1.0 盐酸( 介质① )：取1 肠溶缓释片12 片，采用释放度测定法第二法装置，以0.1 mol/L 盐酸( 取盐酸9 ml，加水稀释至1 L，混匀即得)750 ml为释放介质，转速为150 r/min，温度(37±0.5)℃，经2 h，取释放液适量，过滤，续滤液适量稀释，按“2.1.1”项下色谱条件检测。
pH 1.0 盐酸转pH 7.5 Tris 盐缓冲液( 介质② )：取上述已在pH 1.0 盐酸中释放2 h 的片子，用蒸馏水洗净后投入( 37±0.5)℃的pH 7.5 Tris 盐缓冲液( 取三羟甲基氨基甲烷 60.57 g，加水 9.6 L 和 0.1mol/L 盐酸400 ml 使溶解，调至pH 7.5)1 L 中，转速不变，继续依法操作。分别于3、4、6 和8 h 时取样10 ml( 同时补充同温等量相应介质)，过滤，取续滤液适量稀释，按“2.1.1”项下紫外检测条件测定。
pH 7.5 Tris 盐缓冲液( 介质③ )：取1 肠溶缓释片12 片，以pH 7.5 Tris 盐缓冲液1 L 为释放介质，转速和温度同上，分别于1、2、4 和6 h 取样10 ml( 同时补充同温等量相应介质)，过滤，续滤液适量稀释，按“2.1.1”项下紫外检测条件测定。
pH 6.0 磷酸盐缓冲液( 介质④ )：取1 肠溶缓释片12 片，以 pH 6.0 磷酸盐缓冲液( 取0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液250 ml 与0.2 mol/L 氢氧化钠溶液28.0 ml 混合后，再加水稀释至1 L，摇匀即得)1 L为释放介质，转速和温度同上，分别于1、2、4 和6 h 取样适量( 同时补充同温等量相应介质)，过滤，续滤液适量稀释，按“2.1.1”项下紫外检测条件测定。
水( 介质⑤ )：取1 肠溶缓释片12 片，以水1 L 为释放介质，转速和温度同上，分别于1、2、4 和6 h 取样适量( 同时补充同温等量相应介质)，过滤，续滤液适量，稀释，按“2.1.1”项下色谱条件检测。
2.1.3 1 肠溶缓释片的制备
含药层颗粒制备： 1 原料药过80 目筛备用。按1 000 片的量分称取1 原料药 27.77 g、HPMCK4M 13.92 g、乳糖 80.31 g，投入多功能流化床中，以纯化水为溶剂配制PVP K30 固含量为3.0％的溶液，采用顶喷工艺制粒，调整进风风量使物料处于有序的流动状态，待物料温度达到35 ℃后开始制粒，设置进风温度为55 ～ 60 ℃，风量为35 ～40 m3/h， 雾化压力20 kPa， 供液速度为0.5 ～
0.8 g/min ；PVP K30溶液耗尽后，调节风量为30 m3/h，保持流化状态，30 min 后取出颗粒，过28 目筛网整粒。依次加入二氧化硅，硬脂酸镁混合均匀。
基座层颗粒制备：称取HPMC E5 10 g、乳糖30.48 g、山嵛酸甘油酯 34.52 g，投入多功能流化床中，以纯化水为溶剂配制PVP K30 固含量为5.0％的溶液，同上采用顶喷工艺制粒。向整粒( 过28目筛) 后的颗粒中加入红色氧化铁、二氧化硅、硬脂酸镁混合均匀。
双层片的压制： 按单片量称取含药层颗粒130 mg，基座层颗粒80 mg，用7 号浅凹冲头，预先向中模中倒入含药层颗粒，压制含药层( 硬度50 ～ 70 N)。在含药层基础上倒入基座层颗粒，压制双层片( 硬度60 ～ 80 N)。
肠溶层包衣液的配制：取枸橼酸三乙酯40.2 g，加入热水(70 ～ 80 ℃ )，搅拌至溶解，冷却至室温后加入滑石粉2 g，搅拌下加至Eudragit L 30D-55水分散体40 g 中，过80 目筛得肠溶层包衣液。包衣过程持续低速搅拌。
肠溶层包衣：取双层片投入高效包衣锅中，调节包衣锅参数( 物料温度35 ～ 40 ℃，进风温度40 ～50 ℃，风机转速900 r/min，主机转速10 r/min，蠕动泵0.2 ～ 0.4 g/min，雾化压力100 ～ 150 kPa，顶针压力200 kPa) 待物料温度达到30 ℃时开始包衣。药片增重8.0％～ 15.0％后关闭蠕动泵，继续干燥20 min 后取出，即得1 肠溶缓释片。
2.1.4 体外释放结果
1 肠溶缓释片剂型是双层肠溶缓释片，片芯由含药的含药层与基座层压制而成，两个片层中都具有缓释材料，基座层不含有原料药，起承载、控释作用，通过调节含药层与基座层缓释辅料的种类和用量进而使得药物以一定的规律释放，片芯外包一层一定厚度的肠溶包衣使得药物仅在小肠中释放。结果表明，自制品与参比制剂在pH 1.0 盐酸中2 h内累积释放率均小于10.0％，符合中国药典2015年版关于肠溶缓释片体外释放的规定。自制小试样品与参比制剂在4 种介质中的释放曲线见图1。
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由图1 可知，自制小试样品( 16051801) 与参比制剂在4 种介质中的释放曲线基本吻合，相似因子(f2) 分别为84.0、75.0、92.0、100。此外，在介质②中测定了3 批自制样品的释放曲线，结果显示重现性良好，说明自制处方工艺优良，释放稳定，基本能达到参比制剂标准。
2.2 Beagle 体内药动学试验
2.2.1 试验设计
2.2.2 测定方法
2.2.3 方法学考察
专属性：照“2.2.2”测定方法检测Beagle 犬空白血浆、空白血浆加1( 0.1 ng/ml) 与内标物2(0.1 ng/ml)、Beagle 犬口服参比制剂4 h 时的血浆样品。结果( 图2) 表明，1 和内标2 的相对保留时间分别为0.51 和0.60 min，分离较好，药物与内标
互不影响，色谱峰形较好，内源性物质未出现干扰。
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标准曲线及最低定量限：取系列浓度标准样品，进样分析。以测得的药物与内标物峰面积比值f 对药物浓度c 进行线性回归，得回归方程f=6.76×10-3c+1.18×10-4(r=0.998 3)，表明在0.1 ～ 100 ng/ml范围内线性良好，最低定量限为0.1 ng/ml。
准确度与精密度：制备低、中、高浓度的质控样(0.3、20 和80 ng/ml)，每一浓度水平配制6 份，按“2.2.2”项下血浆样品处理方法处理，以拟定的分析方法操作，每个样品分析测定1 次，每日3 个水平各测定1 次，连续测定3 d。将1 和内标2 峰面积的比值代入标准曲线，用测得值与理论值相比计算准确度和精密度。相对误差( relative error，RE) 表示准确度，相对标准偏差(relative standard
deviation，RSD) 表示精密度。结果表明，低、中、高浓度质控样品的日内和日间RE 值分别为1.42％、3.16％、-3.14％ (n=6) 和5.98％、3.20％、-3.17％
(n=18)，平均RE 值在±15.0％范围内；日内和日间RSD 分别为4.60％、3.39％、2.11％ (n=6) 和5.38％、2.29％、2.62％ (n=18)，平均RSD ≤ 15.0％。
基质效应和提取回收率：基质效应为具有基质的分析物与同浓度的分析物，采用相同的血浆样品处理方法处理，以拟定的分析方法测定目标化合物峰面积的比值；提取回收率为一定浓度的质控样品经药物提取后目标化合物的峰面积与相同浓度质控样品目标化合物峰面积的比值。结果表明，低、高浓度质控样品基质效应因子在0.8 ～ 1.2 范围内，因此可忽略基质效应的影响；低、中、高浓度(0.3、20 和80 ng/ml) 质控样品提取回收率分别为(96.82±3.10)％、(98.36±0.76)％和(101.16±0.80)％，RSD 分别为2.90％、0.77％和0.76％ (n=6)。
稳定性：低、中、高浓度(0.3、20 和80 ng/ml) 质控样品在室温下分别放置12 和24 h，然后照“2.2.2”项下血浆样品处理方法处理，分析测定血浆中药物浓度。同法配制质控样品，于-80 ℃冰箱中保存，分别测定15 和30 d 时的血浆中药物浓度，结果见表1。
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2.2.4 Beagle 犬体内药动学试验结果
8 只Beagle 犬口服1 自制与参比制剂后，均未观察到异常反应，其平均血药浓度- 时间曲线，见图3。
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2.2.5 Beagle 犬体内的药动学参数
根据药物的血药浓度数据，使用药动学计算软件WinNonlin5.2 非房室模型分别计算受试样品在8 只Beagle 犬中药动学参数AUC0→t、AUC0→∞、MRT0→∞、cmax、tmax 和t1/2。8 只Beagle 犬空腹口服自制品与参比制剂后的主要药动学参数，见表2。
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由表2 结果可知，自制品与参比制剂各主要药动学参数接近，且自制品各参数的标准差均小于参比制剂，说明在理论上自制品的变异性优于参比制剂。自制品与参比制剂药动学参数标准差值都较大，首先，可能是由于Beagle犬的生理因素所决定的( 胃肠道较短)，1 肠溶缓释片作为1 个6 ～ 8 h 释放的缓释片，容易受到胃排空的影响；再者，在试验过程中，参比制剂与自制品均存在多个时间点的血药浓度低于定量限的情况，对试验结果有一定影响；本次药动试验采用8 只Beagle 犬，雌雄各半，也有可能是动物数较少导致个体差异较大。
2.2.6 数据处理及统计分析
自制品的cmax 值为市售品相应参数的121.90％( 几何均值)；相对生物利用度为125.13％ ( 几何均值)。将自制品与参比制剂的主要药动学参数进行配对t 检验，其中AUC 与cmax 数据经自然对数转换后进行统计分析，tmax 采用非参数检验进行统计分析，结果表明二者关于主要药动学参数( tmax、cmax 与AUC0→t) 的自然对数无统计学差异，统计分析结果见表3。
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3 讨论
为满足自制品与参比制剂质量的一致性，应保证自制品与参比制剂在不少于4 种介质中体外释放曲线都能够相似。本研究参考相关标准采用4 种介质考察体外释放行为，结果自制品与参比制剂在pH 1.0 盐酸中基本不释放，pH 7.5 Tris 盐缓冲液介质中的药物释放曲线相似，pH 6.0介质8 h释放完全，水中6 h 基本不释放。为进一步探究自制品和参比制剂的制剂特征及质量，建立了体内分析方法，研究二者在Beagle 犬体内的药动学特征，结果也表明二者的主要药动学参数无统计学差异。
目前关于1 肠溶缓释片在Beagle 犬体内药动学研究未见报道，本研究建立了Beagle 犬血浆中1 的UPLC-MS/MS 的分析方法，并对分析方法进行确证，结果符合体内药动学研究的要求。
自制样品批次尚未达到中试规模，动物例数较少，对试验结果的准确性有一定影响，也未对比研究自制品与参比制剂的加速和长期稳定性，故自制品与参比制剂是否生物学等效还需进一步考察。
综上所述，自制品与参比制剂的体外释放基本一致，在Beagle 犬体内主要药动学参数统计学无差异，说明自制品小试较为成功，可为今后自制品处方工艺的放大研究和人体生物等效性试验提供参考。
基金项目：江西省高等学校科技落地计划项目(KJLD13062)、江西省科技计划项目(2014BBG70082)
作者简介：曹 焱(1992—)，男，硕士研究生，专业方向：口服缓控释制剂。
Tel：17778023139
E-mail：370580404@qq.com
通信联系人：李东勲(1966—)，男，副教授，从事药物的新制剂研究。
Tel：0791-87119617
E-mail：1447850774@qq.com
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