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本文刊于 中国实用妇科与产科杂志
2017年5月 第33卷 第5期
作者：王佳燕1a,1b 陈敏1a,1b 吴莉2 苏凤侠3 李南1a,1b 蒋馥蔓3 陈芳3 郭晓玲2 陈敦金1a,1b
作者单位：1 广州医科大学附属第三医院 a妇产科研究所,b产前诊断和胎儿医学中心；2 佛山市妇幼保健院；3 深圳华大基因研究院
目的：探讨无创产前基因检测（NIPT）双胎21、18和13-三体综合征在临床应用的可行性。
方法：选取2012年8月至2014年11月在广州医科大学附属第三医院胎儿医学中心或佛山市妇幼保健院产科中心就诊的双胎妊娠孕妇，其中同意行NIPT检测者共215例，通过对孕妇血浆游离DNA测序来检测胎儿患21、18和13-三体综合征的风险。染色体核型检查是验证NIPT检测准确性的金标准，新生儿体格检查作为辅助检验标准。
结果：3例NIPT检测结果提示为21-三体综合征高风险，经染色体核型检查证实均为双胎之一21-三体综合征；余212例NIPT检测结果为低风险，染色体核型或新生儿体格检查中均未发现异常。本研究中NIPT检测双胎21、18和13-三体综合征的准确性为100%，并降低了侵入性产前诊断的发生率。
结论：NIPT检测双胎21、18和13-三体综合征是产前筛查的一种新选择，将其投入临床应用具有一定可行性。
关键词：双胎,无创产前基因检测,染色体非整倍体,侵入性产前诊断
双胎妊娠通过母亲血清生化的筛查方式能识别约45%的21-三体综合征，结合颈项透明层厚度（NT）测量值后，筛查准确率可升至85%～90%，但假阳性率约10%。侵入性产前诊断的方式获取胎儿遗传物质进行染色体核型分析是诊断胎儿染色体非整倍体的金标准，然而双胎妊娠的孕妇需承担更高的流产、早产、宫内感染等风险。双胎妊娠率的逐年升高与高龄妊娠和辅助生殖技术的广泛应用相关，因胎儿来之不易，孕妇在面对唐氏筛查（唐筛）较高的假阳性率和侵入性产前诊断的流产风险，常陷入焦虑与恐慌之中，所以双胎的产前筛查需要一种更为安全、高效的方式。孕妇外周血中胎儿游离DNA的发现使无创性产前筛查有了希望，随着测序技术和生物信息分析技术的发展与提高，无创产前DNA检测被期待应用于双胎产前筛查工作之中。本研究分两个阶段共收集了215例双胎妊娠孕妇的样本行NIPT检测，旨在初步探讨双胎NIPT检测在临床应用的可行性。
1.1资料来源
研究期间共215例双胎妊娠孕妇于孕12～28周在广州医科大学附属第三医院胎儿医学中心或佛山市妇幼保健院产科中心进行了NIPT检测。研究第一阶段（方法验证阶段）：2012年8月至2013年1月期间，因高龄（年龄≥35岁）、唐筛异常、超声提示胎儿异常就诊的双胎妊娠孕妇，经过详细的遗传咨询后，共45例孕妇同意侵入性产前诊断的同时行NIPT检测。第二阶段（临床应用阶段）：2013年10月至2014年11月期间，NIPT检测通过国家食品药品监督管理局批准后试运用于临床，此阶段共收集了170例双胎妊娠孕妇的样本，包含将NIPT检测作为产前筛查首选的孕妇。
本研究通过所在医院的医学伦理委员会批准，孕妇签署NIPT检测知情同意书后采集其外周静脉血用于后续的测序分析。
1.2方法
1.2.1试验流程
第一阶段：双胎妊娠孕妇在侵入性产前诊断前自愿提供少量外周血用于NIPT检测。NIPT检测及染色体核型分析分别在深圳华大基因研究院及两家医院的实验室独立完成，所有数据在汇总分析前均需保密。
第二阶段：双胎妊娠孕妇经遗传咨询后选择了NIPT检测，当结果为高风险时必须行侵入性产前诊断，低风险病例则规律随访至新生儿出生。随访期间发现异常时则根据具体情况进行合理的产前诊断。出生后的新生儿常规行体格检查，在征求其父母同意并签署同意书后补充新生儿的染色体核型检测结果。
1.2.2样本采集 抽取孕妇外周静脉血5mL置入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，8h内经二步分离法获得血浆，保存于-80℃冰箱，干冰保存并运送至深圳华大基因研究院。随后完成血浆游离DNA的提取，文库构建和测序等工作。样本自接收当日起，10～15个工作日内完成检测。
染色体核型检测按照标准流程进行培养、制片、染色等，根据人类细胞遗传学国际命名体制标准进行核型分析诊断。
1.2.3双胎NIPT检测的生物学信息分析 通过华大研究院自主研发的生物信息分析方式，使用t值和L值来判断染色体非整倍体的风险。结果分为以下3种情况：（1）t值＞2.5且L值＞1提示为高风险，胎儿非整倍体风险高，需进一步行侵入性产前诊断。（2）t值＞2.5或L值＞1提示为警戒风险值，可能因胎儿游离DNA浓度过低或存在胎盘嵌合（异常细胞比例越高越接近高风险，越低则越靠近低风险）等因素所致。当检测结果在警戒区内，需对孕妇进行更为详细的医学咨询，必要时需再次采血、测序或行侵入性检查进行确诊。（3）t值≤2.5且L值≤1提示为低风险，胎儿非整倍体可能性低，随访至新生儿出生。
1.2.4辅助验证 新生儿体格检查作为检验NIPT准确性的辅助验证方法。因21、18、13-三体综合征均具有典型的临床表现，所以通过新生儿体格检查可初步判断是否为患儿。
1.2.5妊娠结局随访 查阅本院电子病历记录系统或电话对所有孕妇的妊娠结局进行追踪随访。随访内容包括胎儿或新生儿是否表现为典型的21、18、13-三体综合征，以及有无流产、引产、减胎，分娩孕周、新生儿出生时健康状况、体格检查结果及有无其他临床诊断和（或）遗传学诊断的异常。
1.3统计学处理
应用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，计数资料用率表示。计算NIPT检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。
2.1双胎妊娠孕妇的基本情况
孕妇年龄（31.68±5.43）岁，其中高龄孕妇71例（33%）。NIPT检测时的孕周（18.83±4.29）周。辅助生殖技术（ART）受孕的孕妇共130例（60.5%），自然受孕39例（18.1%），促排卵46例（21.4%）。单绒毛膜双胎和双绒毛膜双胎分别为45例和159例，余11例绒毛膜性质不详。双胎妊娠的孕妇行NIPT检测的指征见表1。第一阶段超声异常包含3例结构异常病例。第二阶段超声异常的病例主要表现为NT增厚（2.6～3.3mm），可疑鼻骨缺失，肠管回声增强或三尖瓣反流等软指标异常。32例超声检查无异常的孕妇未行唐筛，直接将NIPT检测作为产前筛查首选。
2.2双胎NIPT检测结果
3例NIPT检测结果位于高风险区，余212例NIPT检测结果均提示为低风险。1例因胎儿DNA浓度偏低，第1次检测结果提示为警戒风险值，再次抽血检测得出低风险结果。3例高风险病例的详细信息见表2。
2.3随访结果
本研究失访和流产的孕妇共30例（14%）。共138例有染色体核型结果，其中58例（第一阶段45例，第二阶段13例）通过侵入性产前诊断获得，余80例（第二阶段）为新生儿染色体核型结果。通过新生儿体格检查验证NIPT检测准确性的共51例，均未见典型的21、18、13-三体综合征的外观表现。随访中存在3例不同程度的结构畸形，分别为肛门闭锁、胆道闭锁，心脏大血管异常（染色体核型未见异常）。24例孕妇因双胎之一死胎，或因早产低体重儿救治无效新生儿死亡，或因双胎特有并发症行选择性减胎术等原因仅获得一个新生儿，见表3。
2.4双胎NIPT检测的准确性
本研究无误诊及漏诊病例，所有21-三体综合征均被正确识别，18和13-三体综合征暂无阳性病例，见表4。
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随着双胎妊娠的发生率显著增高，如何对双胎妊娠进行有效的产前筛查受到越来越多的关注。研究显示，NIPT检测单胎21、18、13-三体的准确性分别为99%、97%、92%，假阳性率0.4%，被认为是一种近乎诊断的筛查方式，然而NIPT检测应用于双胎的研究尚缺乏大样本数据的支持。比较已发表的研究，NIPT检测双胎21、18、13-三体的灵敏度分别为91.7%～100%，50%～100%，100%。本研究初步统计得出NIPT检测双胎21、18、13-三体的灵敏度为97.3%、90.9%、100%，假阳性率0的结论。本研究样本量小，但同其他研究结果一致，认为NIPT检测双胎非整倍体的准确性同单胎接近。
在del Mar等的研究中，68例双胎同时进行了NIPT检测和早孕期联合筛查，其中3例被确诊为染色体非整倍体。该研究显示，联合筛查的假阳性率为23.3%（14/60），意味着14例联合筛查阳性的病例中，在包含3例真阳性病例的情况下，将有11例假阳性的双胎孕妇需通过侵入性产前诊断排除胎儿异常，如果为双绒毛膜双胎，穿刺的次数还需增倍，所以血清筛查假阳性的孕妇将承受产前诊断的压力、焦虑及额外的流产风险，同时增加了其经济负担。该研究联合筛查截断值为1∶100时，血清学筛查检测出了2个异常胎儿（共3个），而NIPT检测则将3个异常全部识别，体现出NIPT检测的优势：提高了产前筛查的准确性，降低了因血清学筛查假阳性而行介入穿刺手术的比例。笔者研究的第二阶段中133例双胎确实有效的避免了穿刺所致的流产风险，穿刺率显著降低。将双胎NIPT检测作为一种介于联合筛查和侵入性产前诊断之间的选择，在一定程度上能提高产前筛查的效率并降低穿刺率。
目前NIPT检测主要适用于单胎，其较高的准确性使双胎妊娠的孕妇希望该检测技术能进一步应用于双胎的产前筛查之中。欧洲人类遗传学协会提出具有产前筛查体系的国家，其政府及公共健康组织对于NIPT检测应起到积极的推广作用，将NIPT作为常染色体非整倍体筛查的第一或第二级筛查手段。本研究第二阶段32例超声检查未见异常的低风险孕妇跳过唐筛检查，直接将NIPT检测作为产前筛查的首选方案，即第一级筛查，其中1例非整倍体被正确的识别，其余病例将NIPT检测作为第二级筛查时，2例被证实为高风险，最终染色体核型明确均为双胎之一21-三体综合征，所以，本研究初步认为双胎NIPT检测作为第一或是第二级筛查时能正确的分辨出整倍体和非整倍体，检测的灵敏度和特异度均为100%。在已发表的研究中，Bevilacqua等研究中包含了将NIPT检测作为第一级筛查的人群，在已知妊娠结局的病例中，323例整倍体的NIPT检测结果提示为低风险，阴性预测值为100%。由于样本量有限，双胎NIPT检测作为第一或是第二级筛查的效率是否同单胎相似，还有待更进一步的论证。
Struble等研究显示，双胎NIPT检测的准确性与胎儿游离DNA的量密切相关。单卵双胎因遗传物质一致，在胎儿游离DNA总量达4%时便足以进行检测，与单胎相同。双卵双胎染色体核型常不一致，如果异常胎儿游离DNA量低于临界值4%，而正常胎儿DNA量足够多，在总游离DNA量达到检测所需最低值时，检测结果可能因正常胎“掩盖”了异常胎而提示为低风险，导致假阴性结果的出现。所以双胎NIPT检测需以胎儿较低的游离DNA量，而非总量来评价染色体非整倍体的风险。当然，该方式将使双胎检测的失败率随之升高。研究显示，双胎和单胎一次检测的成功率为94.4%和98.3%，二次检测的成功率上升至96.9%和99.3%，双胎检测的成功率低于单胎。本研究存在1例因胎儿游离DNA浓度过低提示为警戒值，征得孕妇同意后再次抽血检测，最终获得检测结果，重检率为0.47%（1/215）。本研究的重检率低于文献报道，与本研究中的病例并非全部在早孕期进行检测有关，因为胎儿游离DNA的浓度随着孕周增长而增长，所以早孕期胎儿游离DNA浓度通常偏低，容易因浓度不达标而无法进行检测。以较低胎儿游离DNA量进行检测增加了孕妇重复抽血、甚至无法获得有效检测结果的风险，但它更好的保证了检测的准确性。
双胎NIPT检测存在局限性，美国妇产科学会指南提出无创性产前筛查胎儿染色体非整倍体作为一种新的产前筛查方式极具前景，但应告知孕妇无创基因检测不能检测所有染色体，更不能替代产前诊断，如绒毛穿刺和羊膜腔穿刺；它也不能评估胎儿结构异常如神经管缺陷或腹壁缺陷等。当NIPT检测结果提示为高风险时，尽管超声异常的胎儿发生非整倍体的风险更高，但并不能依此诊断异常胎，必须通过侵入性产前诊断进行确诊，以明确受累胎儿的个数及在宫内的位置。已有研究利用单核苷酸多态性成功的检测了双胎的卵性并通过该方法判断了受累胎儿的个数，通过比对胎儿游离DNA中不同的基因组区域，在判断双胎卵性的同时，还计算出两个胎儿分别贡献了多少DNA量。该方法不仅具有科研应用潜力，还可能在临床上对双胎妊娠围产期的管理有利，但因检测的技术要求高，所以尚未能将其常规应用于双胎NIPT检测之中。
本研究尚存在研究的样本量小和对双胎NIPT检测准确性验证不充分的不足之处，但本研究初步显示出双胎NIPT检测具有较好的准确性，将其引入现有的产前筛查体系具有一定的可行性，在广泛应用于临床检测前还需更大样本和更合理的研究方案评估双胎NIPT检测的效力。
参考文献略
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