NGS之外(一):MLPA技术检测拷贝数变异(CNV)

SeqStudio基因分析仪采用独特的一体式盒式磁带，结合了毛细管阵列、聚合物储存器和阳极缓冲液，极大地简化了准备和实际操作时间。SeqStudio仪器占地面积小，内置电脑和集成触摸屏，使运行设置快速，直观和灵活。该系统允许Sanger测序和片段分析在同一板上运行，而无需更换任何消耗品。虽为4通道的小通量仪器，但运行时间快，非常适合医学检验所实验室，据说机器价格还不贵！

大多数人可能不会注意，我们通常说的一代测序仪的学名其实叫Genetic  Analyzer，它除了可以做我们常见的Sanger测序外(行业的金标准)，还有一个重要的应用方向就是片段分析(Fragment Analysis)，上面说的MSI检测就是其中之一，但我们今天不是要讲MSI，我们想介绍片段分析中另一个常见的应用方向---MLPA。

MLPA技术的全称是MultiplexLigation-dependent ProbeAmplification。这项技术的最主要特点，是一次反应，就可以检测最多45个位点的基因拷贝数变异。而且这个方法检测拷贝数变异的准确率非常高。另外，MLPA技术还可以用于检测DNA的甲基化和SNP。今天我们主要讨论MLPA技术在检测基因拷贝数变异当中的应用。接下来，我们分两个方面来谈MLPA技术：MLPA的原理和相对于其它检测基因拷贝数变异方法MLPA技术的优缺点。

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MLPA工作原理

第1步，设计连接引物

每一个目标基因位点，设计一对引物。引物靠中间的部分，与目标序列互补。这一对引物，在基因组的目标位置上，是紧挨着的。因为是紧挨着的，未来可以方便地用连接酶把这一对引物连成一条DNA链。DNA连接酶对被连接的位点有很强的识别能力。如果DNA链之间不能很好地互补，连接反应就不会发生。MLPA技术，就是利用连接酶对连接位点的识别能力，来识别目标位点是否有序列变异。只有在顺序匹配的条件下，连接酶才能把两段DNA连在一起；如果有错配，就连接不上。在每对引物中，其中一个引物的外侧，加上一段无关的填充DNA序列。加上这段填充DNA序列的唯一目的，是让未来的连接产物，有不同的长度。以便于通过电泳，将不同长度的DNA片段给分离开来。引物最靠外侧的部分，是一对通用序列。未来，会用通用PCR扩增探针与这对通用序列互补，进行PCR扩增。一个反应当中，最多设计45个目标位点。长度靠近的两对引物之间，相差至少6到8个碱基的长度。在做毛细管电泳的时候，可以通过DNA片段的长度不同，来把不同的DNA片段给分离开。

第2步，准备通用的PCR荧光探针。

针对引物外侧末端的通用序列，设计带荧光基团的PCR探针。

第3步，实验操作。

把连接引物和样品DNA混合，加热、退火，目的是让连接引物与目标DNA相结合。加入连接酶，进行连接反应。加入PCR荧光探针，和PCR酶，进行PCR反应。然后，把PCR产物用毛细管电泳进行电泳，检测带荧光的PCR扩增片段。

第4步，数据分析。

用软件，对电泳得到的峰的面积进行计算。再通过把样品与标准品的峰的面积进行比较，推算出目标基因位点的基因拷贝数。

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MLPA的技术优势

1、它一次可以检测最多45个位点的基因拷贝数变异，所以它的检测通量是比较高的。

2、它的检测仪器，是用毛细管电泳仪，也就是一代测序仪，所以，对于已经有一代测序仪的用户，它无需额外投入硬件设备。

3、它的检测稳定性是比较好的，它对拷贝数变异的检测结果的准确性是很高的。

4、它操作简单，在整个实验过程当中，包括连接反应、PCR反应，都是常规的分子生物学操作。对于绝大多数的分子生物学实验室，都可以轻松掌握。

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与其他检测CNV的方法相比较

1、与传统的荧光定量PCR相比

荧光定量PCR的一个反应只能检测一个位点，而MLPA方法一次可以检测多达45-51个位点，所以，MLPA技术相对于荧光定量PCR，在通量上有优势。

2、与FISH方法(原位荧光杂交)相比

FISH方法只能检测到大片段的拷贝数变异，对小片段的拷贝数变异不敏感。而MLPA方法可以检测到几十个碱基的小片段的拷贝数变异，所以MLPA方法的分辨率，相对于FISH方法有明显的优势。

3、比较MLPA方法和生物芯片方法，检测拷贝数变异。

生物芯片的通量更高，一次可以检测几万甚至几十万个点。但是生物芯片的操作复杂度更大，而且需要专门的芯片扫描仪，检测一个样本的成本也相对较高。

正是因为MLPA在检测拷贝数变异(CNV)特别是大片段缺失重复上的巨大优势，使得它可以作为NGS测序重要的补充和验证手段。

人类基因组上的变异主要分为三大类：

1、 单核苷酸变异，(通常称为单核苷酸多态性，通俗的说法就是单个DNA碱基的不同，简称SNP)；

2、小的Indel(Insertion 和 Deletion的简写)，指的是在基因组的某个位置上所发生的小片段序列的插入或者删除，其长度通常在50bp以下；

3、 大的结构性变异，这种类型比较多，包括长度在50bp以上的长片段序列的插入或者删除、染色体倒位、染色体内部或染色体之间的序列易位、拷贝数变异以及一些形式更为复杂的变异。

随着二代测序技术的快速发展，靶向富集高通量测序技术(基于杂交捕获或者多重PCR)得到了广泛的应用，可以非常高效的检测出SNP和小的Indel，但NGS也并不是万能的。比如靶向富集高通量测序有一个不足之处，就是它对于基因的拷贝数变异不敏感。原因是杂交捕获探针与目标DNA杂交时的杂交效率有很大的波动，而多重PCR扩增时的不同引物间的扩增效率也有很大的差别。正是这些波动和差别，会使目标区域测序得到的测序深度会有较大的波动。这样靶向富集测序得到的测序深度，不能很好地代表目标基因的拷贝数多少。虽然可以通过后期探针优化和分析方法改进来解决，但是到目前为止还是没有很好彻底解决这个缺陷。而MLPA技术能够很好地检测多个位点的基因拷贝数变异，所以MLPA技术作为靶向富集高通量测序的有力补充，得到了广泛的应用。

随着安吉丽娜.朱莉事件，BRCA1/2基因检测逐渐被大家所认识和重视。BRCA1/2是乳腺癌易感基因，其胚系突变使得女性患乳腺癌的风险明显增加，CNV(拷贝数变异)占BRCA1/2突变类型的10%左右。不久前权威医学杂志《新英格兰医学杂志》发布重磅研究数据：BRCA1/2突变的晚期乳腺癌患者使用抗癌药奥拉帕尼比使用化疗效果好，副作用小，肿瘤进展或者死亡率降低42%。

这就使得无论是高危人群还是患者的检测需求大大增加，也使得基因检测公司鱼龙混杂。据了解，在开展BRCA1/2基因检测服务的基因检测公司或单位，大部分公司都是基于NGS平台开展的，且没有其他辅助手段。也就是说在某些情况下，可能会漏掉大片段拷贝数变异(CNV)的检出，而这一类型的突变占到所有可能突变的10%左右。消费者还是需要选择严谨、可靠的实验室来进行基因检测。

誉衡基因——普瑞安(Pre-BRCA)-BRCA1/2基因检测

誉衡基因的普瑞安产品基于高通量测序平台，对 BRCA1/2 的全外显子进行胚系突变检测，外加MLPA技术辅助检测突变中可能出现的拷贝数变异，力争对BRCA1/2基因突变类型一网打尽，提供更为精准和全面的基因变异信息。通过对乳腺癌易感基因BRCA1/2的检测，以达到对潜在乳腺癌患者早期的筛查干预和精准用药指导的目的。