测序文章详细解读丨来茂德教授《Gut》发文揭示SRSF6作为CRC治疗靶标可调节可变剪接促进肿瘤进展

摘 要

目的：探讨剪接因子SRSF6在结直肠癌（CRC）进展中的分子功能，并发现可靶向SRSF6的候选化学药物，其能够用于癌症治疗。

设计：作者对311例CRC样本中SRSF6的表达进行了全面分析。在体内和体外进行结直肠癌SRSF6的功能分析。通过下一代RNA测序和RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）鉴定SRSF6调节的可变剪接（AS）及其结合基序，通过凝胶迁移和微小基因报告测定进行验证。研究了ZO-1 exon23 AS在体外和体内介导调节SRSF6的功能。基于特异性功能位点作用分析，通过药物虚拟筛选在4855个FDA批准的药物中重新发现SRSF6靶向抑制剂，并且在体外和体内评价其抗肿瘤作用。

结果：SRSF6在CRC样本中频繁上调，且与预后不良有关，促进体外和体内CRC细胞增殖和转移。作者鉴定了SRSF6调控的AS靶标并发现了SRSF6结合基序。特别地，SRSF6通过直接结合其exon23的基序来调节ZO-1异常剪接，从而作为致癌基因的功能。基于SRSF6 RRM2结构域在调节AS和生物学功能中起关键作用的结果，茚达特罗（indacaterol）是一种被批准用于慢性阻塞性肺病治疗的β2-肾上腺素能受体激动剂，其被确定为SRSF6的抑制剂从而抑制CRC的致肿瘤性。

结论：SRSF6通过调节AS在介导CRC的过程中发挥了重要作用，茚达特罗（indacaterol）通过靶向SRSF6被重新定位为抗肿瘤药物。

背

景

       mRNA的可变剪接（AS）产生多种差异剪接RNA转录本。作为癌症的一个新的标志，AS已经涉及多种肿瘤学过程，包括血管生成，侵袭和转移。丝氨酸/精氨酸富集（SR）RNA结合蛋白家族是集中于核散斑体的剪接因子，在组成性剪接和AS中起关键作用。作者之前研究显示SRSF6是一种SR蛋白，可作为lncRNA LINC01133靶点，抑制结直肠癌EMT和转移。最近研究认为SRSF6是一种在人类皮肤癌中经常过表达的原癌基因，其在转基因小鼠中的过表达可诱导致敏皮肤的增生并促进异常的AS。尽管SRSF6基因拷贝数在肺癌和CRC中被扩增，但是迄今为止仅有少数内源SRSF6 AS靶标被报道，并且SRSF6过表达的生物学后果仍不清楚。此外，靶向致癌SR蛋白的候选药物制剂尚未被发现。

实验流程

1、CRC中SRSF6的表达分析：qRT-PCR

2、SRSF6体外功能研究：免疫印迹、CCK-8试验、软琼脂集落形成实验、Transwell试验、SRSF6 shRNA等

3、SRSF6体内作用：异种移植模型、SRSF6 shRNA、免疫反应性测定、H&E染色分析、荧光成像实验等

4、鉴定SRSF6调节的AS事件：RNA-seq（该测序服务由锐博生物提供）、RT-PCR、RIP-seq、免疫沉淀反应、凝胶迁移、微小基因报告系统、免疫印迹等

5、ZO-1在CRC发展中的作用（体外实验验证）：RT-PCR 、siRNA、SRSF6 shRNA、Transwell试验、

6、SRSF6通过调节ZO-1 AS促进肿瘤进展（体内功能研究）：动物模型构建、RT-PCR、免疫印迹、shRNA等

7、SRSF6特异性药理学抑制剂（茚达特罗）的筛选：SRSF6 shRNA、虚拟高通量筛选、免疫印迹、RT-PCR、Transwell试验、凝胶迁移等

实验结果

1、CRC中SRSF6的表达

图1

首先，作者研究了来自TCGA RNA-seq数据集，TCGA基因表达微阵列数据集，GEO GSE31737数据集和GDS4382数据集中匹配的CRC和正常组织样品中SRSF6的表达水平，结果显示这些数据库中的肿瘤组织样品具有显著的SRSF6上调。qRT-PCR检测311对匹配的CRC和正常组织中的SRSF6，得到同样的结果（Fig1E）。作者进一步评估了SRSF6的预后价值，发现与SRSF6_low患者相比，SRSF6_high患者总生存期显著降低（Fig1F）。这些临床数据有力地将SRSF6表达与CRC发展和预后联系起来。

2、SRSF6在体外促进CRC增殖、迁移和侵袭

图2

在SW620、RKO、SW480、HCT116、HT29和HCT8细胞系中敲降SRSF6，所有细胞系的增值能力显著被抑制（Fig2CD）。软琼脂集落形成测定显示shRNA介导的SRSF6敲降细胞表现出贴壁不依赖性生长的显著减少（Fig2EF）。有趣的是，SRSF6敲降细胞的SRSF6重新表达可挽救SW620和RKO细胞系的增值能力（Fig2IK），并且贴壁不依赖性生长也重新恢复。Transwell迁移和侵袭试验显示SRSF6表达的缺失可以降低所有细胞系中的迁移和侵袭潜力（Fig2MN），挽救实验又能增强其迁移和侵袭潜力。表明SRSF6可促进CRC增殖、迁移和侵袭。

3、SRSF6在体内介导CRC进展

图3

接下来，作者在体内研究了SRSF6在CRC肿瘤发生和进展中的作用。首先构建异种移植模型，研究显示SRSF6-shRNA的异种移植肿瘤体积在体内显著降低，并且抑制肿瘤细胞增殖，SRSF6敲降也抑制肿瘤生长（Fig3）。

图4

SRSF6在体外可以促进CRC细胞迁移和侵袭，那么SRSF6是否在体内影响肺转移？荧光成像实验显示SRSF6-shRNA SW620细胞比对照细胞更晚表现出肺转移能力。表明SRSF6可能对肺转移的外渗或早期播散产生积极影响。并且注射SRSF6-shRNA细胞的小鼠肺转移生长减少（Fig4D）。H&E 染色显示SRSF6-shRNA细胞产生的转移灶数量和大小显著减少（Fig4E）。重要的是，SRSF6的敲降显著延长小鼠的生存，SRSF6-shRNA细胞注射的小鼠存活率得到改善，死亡率下降了62.5％（Fig4F）。表明SRSF6促进CRC的发展并促进肿瘤转移。

4、鉴定SRSF6调节的AS事件

图5

作者对control和SRSF6敲降的SW620细胞的3对独立RNA样品进行下一代RNA-seq，共鉴定了1158个SRSF6调节的AS事件。其中，719个AS事件的PSI（percent spliced in）指数上调，439个AS事件的PSI下调。这些AS事件中超过60％对应于盒式外显子（CA）。SRSF6的敲降调节481个外显子跳跃和677个外显子内含物变化（Fig5），表明SRSF6可作为剪接激活剂和阻遏物的双重作用。RT-PCR进一步验证RNA-seq的准确性。这些SRSF6调节的AS事件的分子功能主要集中在细胞粘附分子结合途径。

为了进一步研究SRSF6对AS的调节机制，作者使用SRSF6调节CA事件的重叠外显子序列和来自RIP-seq数据的SRSF6结合转录本，重新发现了SRSF6结合基序。

图6

ZO-1是一个重要的细胞粘附分子，可能与SRSF6的分子功能相关。因此，作者搜索了ZO-1 mRNA序列中的SRSF6结合基序。发现在ZO-1 exon23中具有与预测的SRSF6结合基序一致的基序序列（UGGAG）。作者使用RNA探针结合免疫沉淀反应实验（Fig6F）表明该基序第1个核苷酸U和第3个核苷酸G是SRSF6结合其靶标的关键位点。通过RNA免疫沉淀实验，发现SRSF6（SRSF6-flag）的过表达可以直接结合并pull down内源ZO-1 mRNA，但是空载体不能（Fig6G）。

图7

目前的数据证实了SRSF6可以结合ZO-1 exon23的基序，SRSF6是否能够激活ZO-1 exon23的剪接仍然是未知的。因此，作者构建了微小基因报告系统，其中exon23跳跃（ZO-1 E23-）保留了EGFP的完整开放阅读框（ORF），而外显子23内含物（ZO-1 E23+）破坏了EGFP的ORF并降低了其表达。结果表明SRSF6敲降引起了EGFP信号的显著减少（Fig7H）。RT-PCR也显示敲降SRSF6可抑制ZO-1 exon23跳跃（Fig7I），表明SRSF6可激活ZO-1 exon23的剪接。所以，作者推测SRSF6可以通过结合其特定的基序来调节AS事件在CRC中的作用。

5、ZO-1的异常剪接促进了CRC体外迁移和侵袭

图8

鉴于SRSF6参与了CRC的进展，并促进了ZO-1 exon23的剪接，作者推测ZO-1剪接变体也可能在CRC发展中起作用。因此，设计了2对siRNA分别用于敲降ZO-1 exon23内含物(ZO-1 E23+)变体以及ZO-1 exon23 内含物(ZO-1 E23+)和ZO-1 exon23跳跃 (ZO-1 E23−)变体。SRSF6 shRNA处理减少SW620迁移和侵袭活性，当用siRNA敲降SW620中的ZO-1 E23+转录本时，其迁移和侵袭活性被部分挽救（Fig8）。

图9

为了进一步研究ZO-1剪接变体在CRC中的作用，作者检测了6种CRC细胞系中ZO-1 E23+和E23-变体的表达。结果表明HCT8和HT29细胞系中两种变体均表达，其他4种细胞系仅有ZO-1 E23−变体表达（Fig9C）。用siRNAs敲降RKO和SW620细胞系中的ZO-1 E23−变体，细胞的迁移和侵袭能力未发生变化；而敲降HCT8细胞系中的ZO-1 E23+和E23−变体显著促进细胞迁移和侵袭（Fig9I）。更有意思的是，特异性敲低ZO-1 E23+变体个别地引起HCT8细胞迁移和侵袭活性的显著增加（Fig9K），表明ZO-1 E23+变体在细胞迁移中起重要的抑制作用。总之，ZO-1的异常剪接可能介导SRSF6在体外至少部分地促进CRC细胞迁移和侵袭活性。

6、SRSF6在体内通过调节ZO-1 AS促进肿瘤进展

图10

接下来，作者评估了SRSF6对体内ZO-1 exon23剪接的影响。通过检测异种移植肿瘤样本中SRSF6和两种ZO-1剪接变体的表达显示在SRSF6敲降组中ZO-1 E23+的表达是上调的（Fig10A）。作者使用小鼠结肠炎相关的CRC模型来验证这些作用。结果显示与正常结直肠上皮组织相比，小鼠CRC模型结直肠肿瘤组织中SRSF6的表达增加，有趣的是，ZO-1 E23+变体的表达显著下调，而ZO-1 E23−变体则上调（Fig10CD），并且小鼠结直肠肿瘤中ZO-1 exon23的PSI指数明显减少（Fig10E）。此外，在这些小鼠模型中，SRSF6表达与PSI指数之间存在显著的负相关（Fig10F）。

图11

此外，作者检测了临床CRC组织中两个ZO-1剪接变体的表达，结果显示ZO-1 E23+变体的表达显著上升，而E23−变体减少。CRC样本ZO-1 exon23的PSI指数比正常组织更低，并且PSI指数较低的患者生存率较差。Spearman相关分析显示CRC组织中SRSF6的表达与ZO-1 exon23的PSI指数负相关（Fig11）。进一步支持作为ZO-1 exon23剪接激活因子的SRSF6的作用，并且进一步表明其可以促进CRC进展。

7、茚达特罗作为SRSF6的药理学抑制剂阻断CRC进展

图12

SRSF6可以调节AS促进CRC进展，那么SRSF6是否可以成为治疗靶点？首先，作者研究了CRC中SRSF6特定功能位点的作用。通过产生不同的SRSF6缺失突变，当把这些缺失突变转染到含SRSF6 shRNA的SW620细胞时，发现RRM1缺失突变体可以显著降低ZO-1 exon23内含物转录，更重要的是，可以挽救SW620细胞在SRSF6 shRNA处理过程中的迁移和侵袭活性；但是RRM2缺失或RRM1＆RRM2缺失突变则不能（Fig12）。

图13

为了进一步验证SRSF6 RRM2结构域在调节ZO-1 exon23 AS中的作用，作者通过免疫沉淀和凝胶迁移实验显示只有SRSF6全长蛋白和RRM1缺失突变蛋白可以结合特定的基序（Fig13F）。表明SRSF6的RRM2结构域在CRC进展中可识别其调节AS的基序。

接下来，作者就想要找到SRSF6的特异性药理学抑制剂。由于RRM2结构域在SRSF6蛋白功能中起着关键的作用，因此作者着重于RRM2结构域，从Drugbank数据库中的4855个FDA批准的药物中寻找第一个靶向SRSF6的抑制剂。最后，通过虚拟高通量筛选发现茚达特罗（用于治疗COPD的长效β2受体激动剂）可以显著抑制SRSF6蛋白的功能。与RRM2结构域结合期间，茚达特罗与GLU72和ASP59残基侧链形成两个氢键，并且与LEU58残基骨架形成两个氢键（Fig13G）。

图14

为了调查茚达特罗的抗肿瘤作用，作者评估了药物对CRC细胞的细胞毒性作用。发现茚达特罗以剂量依赖性方式杀死SW620细胞，并且在RKO，HCT116和HCT8细胞中具有类似的细胞毒性作用（Fig14H）。此外，茚达特罗的抑制率随着处理时间的延长而增加（Fig14I）。与SRSF6敲降类似，茚达特罗可抑制SW620细胞迁移和侵袭（Fig14J）。有趣的是，茚达特罗也调控一些异常AS事件，包括ZO-1、ECM1。表明茚达特罗可能是体外抑制CRC进展的SRSF6靶向抑制剂。

图15

此外，作者使用小鼠结肠炎相关CRC模型在体内评估茚达特罗的药理作用。结果显示茚达特罗可以显著抑制CRC形成（Fig15K）。此外，当茚达特罗注射剂量达到2.5mg/kg，这些CRC模型小鼠未观察到肿瘤（Fig15L）。总之，茚达特罗被重新定位为通过靶向SRSF6来调节AS从而抑制CRC进展的新型治疗剂。

原文：Wan L, Yu W, Shen E, et al. SRSF6-regulated alternative splicing that promotes tumour progression offers a therapy target for colorectal cancer[J]. Gut, 2017: gutjnl-2017-314983.

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