【专家论坛】闫惠平:如何认识原发性胆汁性胆管炎自身抗体的临床意义

一、AMA

1. AMA是PBC诊断标志性自身抗体：90%～ 95%的PBC患者可检测到该抗体。AMA并非绝对特异性自身抗体，在某些人群中也有一定阳性率^[1-3]。我们报道AMA-M2抗体在病毒性等肝病中会出现低滴度阳性^[4]。尽管如此，在排除其他原因导致的肝内胆汁淤积后，AMA对PBC具有高度诊断价值。

2. AMA的靶抗原：AMA于1965年在PBC患者血清中首次被发现。1987年，美国加利福尼亚大学戴维斯分校Gershwin教授领导的研究小组首次利用PBC患者血清中的AMA鉴定和克隆出了它的靶抗原：丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基（ PDC-E2）^[5]。

对AMA的深入分析发现，这些抗体是针对位于线粒体内膜上的2-酮酸脱氢酶复合物（2-oxoacid dehydrogenase complexes，2-OADCs）的，2-OADCs由三种成分组成：PDC-E2、酮戊二酸脱氢酶复合体E2亚基（E2 subunit of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex，OGDC-E2）和丙酮酸脱氢酶复合体侧链E2亚基（E2 subunit of the branched-chain 2-oxoacid dehydrogenase complex，BCOADC-E2）。与AMA特异性反应的抗原表位主要位于内侧的硫辛酸结构域^[6-7]。

3. AMA的分型：抗线粒体抗体分为M1～M9 九个亚型，其中M2是PBC的主要亚型，其次，M4 （亚硫酸盐氧化酶）、M8（未被鉴定的胰蛋白酶敏感抗原）和M9（糖原磷酸化酶）也可以同PBC血清结合^[8]。M2抗体的应用更普遍。

4. AMA的疾病预测作用：自身抗体有可能是自身免疫疾病最早出现的指标，AMA可早于临床症状和生化异常前几年检测到。Hirschfield和Gershwin^[9]报道，在PBC患者一级亲属中，母女、姐妹间AMA的阳性率为10%～20%，远高于普通人群的检出率。同时，部分PBC患者合并干燥综合征、自身免疫性甲状腺炎等疾病。因此，建议PBC患者的女性家属检测AMA和ANA，有利于疾病的早期发现。不过，仅有AMA阳性还不足以诊断PBC，欧洲肝脏病学会（European Association for the Study of the Liver，EASL）和我国的指南均推荐对血清肝功能正常但是AMA阳性者应进行随访，每年检测生物化学指标对肝病情况进行评估^[1-2]。

5. 临床问题：AMA-M2阴性就是线粒体抗体阴性PBC吗？理论和临床实践均可以证明，仅依据一种检测方法（或单一抗原）得到的AMA-M2阴性结果即诊断患者为“AMA阴性PBC”，有可能存在假阴性。应联合其他方法，如间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）检测AMA或酶联免疫吸附法（ELISA）对AMA-M2定量检测，以排除假阴性结果。包被抗原的差异、方法学的差异等因素均可能导致检测结果的假阴性。

如前所述，AMA的靶抗原是一个复合物，至少包括三种成分的抗原。包被抗原的选择及数量与检测结果相关。Han等^[10] 对79例PBC（其中35例有肝组织学诊断），108例其他肝病患者，比较了不同厂家四种试剂检测AMA-M2的结果，见表1。若ELISA（AMA-M2阳性）结合间接免疫荧光法（AMA 1∶80以上为阳性）检测，对PBC的诊断敏感性可达88.6%,特异性可达99.7%。

Dähnrich等^[11]ELISA检测抗原为纯化的天然抗原PDC和MIT3的混合物（抗M2-3E），检测结果显示诊断准确性超过常规ELISA和IIF。也有报告认为不论天然抗原或是重组抗原检测AMA-M2均有高度敏感性。

二、ANA

众所周知，ANA可见于多种自身免疫疾病，是典型的器官组织非特异性自身抗体。在自身免疫肝炎（AIH）、PBC和原发性硬化性胆管炎均可阳性^[12]。需要指出的是，国内外的PBC指南中都强调了“PBC特异性抗核抗体”这个概念，它对AMA阴性的PBC诊断具有重要作用^[13]。什么是“PBC特异性抗核抗体”？即：核点型ANA或核周型ANA（采用IIF法检测所观察到的荧光核型）、抗-gp210和抗-sp100。

1. ANA的荧光核型： ANA是一组自身抗体，因被检血清中存在不同性质的特异性ANA，检测时血清与底物靶抗原结合而后加入荧光素标记的第二抗体，通过荧光显微镜可观察到形态各异的荧光染色图像，称为ANA的荧光核型（nuclear pattern）。核型的命名目前并未统一，可以“ANA核型的国际共识”^[14]中的名称作为依据。以Hep-2细胞为基质，位于细胞核的ANA有核均质型、核颗粒型、核点型、核着丝点型、核仁型等多种类型。某些ANA核型对疾病有较明确的诊断意义，例如核均质型，一般对应抗双链DNA，是系统性红斑狼疮的重要诊断指标。关于ANA谱的检测，欧洲自身免疫标准化促进会和风湿及相关疾病自身抗体标准化委员会发表了专家建议，其中包括：ANA应作为自身免疫和风湿免疫病的初筛项目；ANA阳性时，应当根据其核型和临床背景进行相应的抗可溶性核抗原抗体检测^[15]，即进行相应的特异性ANA的检测。

2.核点型ANA及核周型ANA：是EASL的PBC指南所称的两种对PBC具有特异性的ANA核型。闫惠平等^[16]于2005年报道，我国PBC患者ANA的主要荧光模式为细胞核膜型、细胞核点型和着丝点型，少见的荧光模式有抗SSA/SS B、细胞核均质型、核仁型及颗粒型等。

核点型（nuclear dots）ANA，可再分为多核点型（multiple nuclear dots）和少核点型（few nuclear dots），其靶抗原主要包括sp100（可溶性酸性磷酸化核蛋白）、sp140、早幼粒细胞性白血病抗原（PML）以及微小泛素相关修饰因子（SUMO）等^[17-18]。ANA的核周型也称核膜型，英文表述为：nuclear envelope、rim-like/membranous （RL/M）或perinuclear rims。核膜由3种主要的结构成分组成：将核周空间分离的双核膜、黏附于核内膜的核板层素网和核孔复合物。其中核孔复合物主要包括核孔膜糖蛋白：相对分子质量210×10³的跨膜糖蛋白gp210和62×10³ 的p62跨膜蛋白。

3.抗-gp210和抗-p62：是针对gp210和p62蛋白的抗体，一般对应于ANA核膜型。抗-gp210对PBC诊断具有高度特异性（> 95%），在PBC患者中的阳性率约为8%～30%，可以辅助AMA阴性PBC的诊断。抗-gp210与更严重的胆汁淤积症和较差的长期预后相关^[19]，也可以作为预测预后的指标。Rigopoulou等^[20]研究发现，与其他IgG亚型相比，IgG3-抗-gp210可能与疾病的严重程度相关。抗-p62在PBC患者中阳性率约为14%～32%，可能与晚期或进展型PBC有关。

4.抗-sp100：是针对sp100抗原的抗体，一般对应ANA核点型。在PBC患者中的阳性率约30%，在其他自身免疫性疾病中的出现率仅3%，对PBC诊断的特异性> 95%，也是AMA阴性PBC的辅助诊断指标。而临床病例分析未见到抗-sp100与PBC患者的预后有明显相关性^[19]，EASL-PBC指南推荐在患者伴有胆汁淤积和特异性ANA荧光模式（核点型或核周型）或ELISA的结果（sp100, gp210抗体）时可以诊断AMA阴性PBC。

5.临床问题：PBC患者AMA和ANA同时高滴度阳性，据此就可以确诊为PBC-AIH重叠综合征吗？回答是否定的。如前阐述，“PBC特异性ANA”不仅见于AMA阴性PBC，在70%～80%的AMA阳性PBC中同样呈现高滴度阳性^[21]，并不提示患者伴有其他自身免疫疾病。而AIH的ANA多呈现核均质型或核颗粒型^[12]。因此，应理解ANA核型的意义，结合生物化学指标和其他免疫指标，做出重叠综合征的正确诊断。

除了PBC-AIH重叠综合征外，PBC患者还可能合并干燥综合征、自身免疫性甲状腺炎、类风湿关节炎等疾病。当PBC患者ANA（抗可溶性核抗原抗体）报告为抗- SSA/SSB、抗双链DNA或抗- Ro52时，不要忽略干燥综合征、系统性红斑狼疮等疾病的排查^[22-24]。

三、PBC相关自身抗体的新进展

抗-KLHL12（anti- kelch-like 12）和抗- HK1（anti-hexokinase-1）抗体是近年来在PBC患者中发现的两种新的自身抗体。KLHL12是一种调节COPII组件的核蛋白，KLHL12位于细胞核内，是胶原蛋白输出的关键^[25]，结合并指导多巴胺D4受体和Dishevelled蛋白泛素化^[26]。HK1是一种位于线粒体外膜，使葡萄糖磷酸化产生6-磷酸-葡萄糖的酶^[27]。抗-KLHL12和抗-HK1抗体可以采用免疫印迹法和ELISA法进行检测。Norman等^[28]报道抗-KLHL12和抗-HK1抗体在PBC患者中的检出率显著高于疾病对照组(P < 0.01)，对PBC诊断高度特异（≥ 95%），同时敏感性高于抗-gp210和抗-sp100。这两种抗体可以在10%～35%的AMA阴性PBC患者中被检测到，认为其可以作为PBC诊断的一个辅助指标。

近年来，许多其他领域的技术方法迅速转向自身抗体检测领域，包括化学发光法、luminex磁珠测定、基因芯片和酶抑制测定技术等，传统的检测技术将面临巨大的挑战。